Hasta örneklerine benzer kan pıhtısı üreten ve klinik ilgili trombolitik tedaviye yanıt veren bir inme modeli oluşturmak istiyoruz. Bu nedenle, klasik fototrombotik inme modelini değiştiriyoruz ve fotoaktivasyondan önce trombin ve fotodinamik boya gül bengalini karıştırıyoruz. Bu prosedürün gerçekten de tPA aracılı tromboliz için oldukça hassas olan kan pıhtısı oluşturmasından memnunuz.
Bu modifiye fototrombotik inme modeli, düşük mortalite oranına sahip çok basit cerrahi prosedürler kullanır ve oldukça tutarlı bir enfarktüs boyutu ve konumu üretir. Ayrıca akut inme hastasındakine benzer bir fibrin ve trombosit karışık kan pıhtısı üretirsiniz. Bu nedenle, daha etkili trombolitik tedaviler geliştirmek için klinik öncesi inme araştırmaları için oldukça yararlı olduğunu düşünüyoruz.
Modelimizi daha fazla insanın kullanmasını umuyoruz. Prosedürü gösteren, grubumuzdaki araştırma görevlisi doçentimiz Dr.Yu-Yo Sun olacaktır. Ameliyattan 30 dakika önce, bir analjezik enjekte ederek fareyi hazırlayın.
Fareyi uyuşturduktan sonra, tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için ayak parmağınızı sıkıştırın. Daha sonra sol boyun ve baştaki tüyleri tüy dökücü kremle alın. Fareyi sırtüstü pozisyonda küçük hayvan adaptörünün üzerine yerleştirin ve cerrahi cilt bölgesini üç alternatif povidon iyot ve %70 etanol ile silerek sterilize edin.
Diseksiyon mikroskobu altında, orta hattın yaklaşık 0,2 santimetre lateralinde bir çift mikro makas ve düz forseps kullanarak 0,5 santimetre sol servikal kesi yapın. Daha sonra, bir çift ince tırtıklı forseps kullanarak, LCCA'yı ortaya çıkarmak için yumuşak dokuyu ve fasyayı ayırın. Daha sonra bir çift ince pürüzsüz forseps kullanarak, LCCA'yı vagal sinirden dikkatlice ayırın.
5-0 ipek sütür kullanarak LCCA'nın etrafına kalıcı bir çift düğümlü sütür yerleştirin. Fareyi yüzüstü konuma çevirin ve burun klipsi rulosunu 15 derece döndürün. Daha sonra cildi üç alternatif Betadine ve% 70 etanol ile silerek cerrahi alanı sterilize edin.
Temporalis kasını ortaya çıkarmak için sol göz ve kulak boyunca bir çift mikro makas ve düz forseps kullanarak kafa derisinde 0,8 santimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra, sol parietal kemikteki temporalis kasının kenarı boyunca 0,5 santimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra temporalis kası üzerinde 0.3 santimetrelik ikinci bir dikey kesi yapın ve parietal kemiğin ve skuamöz kemiğin kenarını ortaya çıkarmak için kası geri çekin.
Frontal ve parietal kemikler arasındaki koronal sütürün dönüm noktasını görselleştirdiğinizden emin olun. Daha sonra, sol MCA'yı ortaya çıkarmak için steril salin uygulayarak kafatasını nemlendirin ve skuamöz kemik üzerindeki proksimal MCA dalını bir işaretleyici ile işaretleyin. Pnömatik bir diş matkabı ile bu işaretli alanı çevreleyen bir milimetre çapında bir daireyi yavaşça çizin.
Ardından, alt duraya dokunmadan kafatasını yaklaşık 0,2 milimetre derinliğinde inceltin. Çok ince bir kemik tabakası kaldığında delmeyi durdurun. Daha sonra, farenin vücut ağırlığına göre trombin ve gül bengal çözeltisini karıştırın ve karışımı 31 gauge iğne ile retro-orbital sinüse yavaşça enjekte edin.
Kuruluğu önlemek için her iki göze de göz merhemi sürün. Aydınlatıcıyı 532 nanometre lazer ışığıyla delinmiş alana 20 dakika boyunca iki inçlik bir mesafede uygulayın. Lazer projeksiyon gözlükleri ile MCA'nın proksimal dalındaki aydınlatmayı görselleştirin.
20 dakika sonra lazer aydınlatmasını durdurun. Kafatasının parietal kemiği üzerinde üç milimetre çapında bir kafatası penceresi yapın ve üzerine bir kapak camı yerleştirin. Ardından distal MCA'yı 20x suya daldırma objektif merceğinin altına yerleştirin.
Görüntülemeden beş dakika önce DyLight 488 konjuge anti-GP1b-beta antikorunun kuyruk damarı enjeksiyonu ile dolaşımdaki trombositi etiketleyin. Daha sonra retro-orbital olarak trombin ve gül bengal çözeltisi karışımını enjekte edin. 10 mikrometre çapında bir lazer ışını ile 532 nanometre lazer sistemi kullanarak MCA'yı fotoaktif hale getirin ve görüntüyü trombüs oluşana kadar kaydedin.
TPA uygulaması için, anestezi uygulanmış hayvanı 37 santigrat derece ılık bir ped üzerine yerleştirin. Kuyruğunu, seçilen fotoaktivasyon sonrası zaman noktasında bir dakika boyunca 45 santigrat derece ılık ıslak gazlı bezle sarın. Daha sonra, rekombinant insan tPA'sını kuyruk damarından enjekte edin.
%50'sini bolus olarak enjekte edin ve kalan %50'yi bir infüzyon pompası kullanarak 30 dakika boyunca demleyin. Serebral kan akışını izlemek için, kafatası açıkta kalacak şekilde kafa derisinde orta hat kesisi yapın. Kafatasını steril tuzlu suyla nemlendirin ve üzerine ultrason jelini nazikçe uygulayın, jelde saç veya hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
Lazer benek kontrast görüntüleyici altında her iki serebral hemisferdeki serebral kan akışını 10 dakika boyunca izleyin. İmmünofloresan etiketleme, gül bengal boyası bazlı fototrombozda, MCA dalının CD41 pozitif trombositler ve az miktarda fibrin ile yoğun bir şekilde paketlendiğini göstermektedir. Buna karşılık, trombin artı gül bengal fototrombozunda, MCA dalı rastgele karışık trombosit ve fibrin pıhtıları ile tıkandı.
İmmünoblotlama analizi, trombin artı gül bengal fototrombozunda ipsilateral hemisferde fibrin birikiminde tek başına gül bengal'e kıyasla iki kattan fazla bir artış gösterdi. Konfokal mikroskop tabanlı intravital görüntüleme, intravenöz trombin enjeksiyonunun lazer aydınlatması altında bile trombosit agregatlarını indükleyemediğini gösterdi. Trombositler, gül bengal fototrombozu modelinde homojen pıhtılar oluştururken, trombin artı gül bengal modelinde çok sayıda soluk bölgeye sahip düzensiz agregalar oluşturdu.
Aynı farenin tPA öncesi ve sonrası 24 saat içinde araç tedavisine karşı CBF'si, lazer benek kontrast görüntüleme ile ölçüldü ve kontralateral hemisfere normalize edildi. Gül bengal fototrombozunda, tPA tedavisi, özellikle iskemik sınır bölgesinde, araçla tedavi edilen farelere kıyasla CBF iyileşme eğilimine yol açtı. Trombin artı gül bengal fototrombozunda, tPA ile tedavi edilen farelerde CBF'nin iyileşmesi daha belirgindi ve proksimal MCA dalları genellikle 24 saatte görünür hale geldi.
Gül bengal fototrombozunda, araçla tedavi edilen ve tPA ile tedavi edilen farelerde benzer bir enfarktüs boyutu tespit edildi. Buna karşılık, trombin artı gül bengal fototrombozunda, tPA litik tedavisi, araçla tedavi edilen farelere kıyasla fotoaktivasyondan altı saat sonra 0.5, bir veya iki saatte enfarktüsü önemli ölçüde azalttı, Trombin aracılı fibrin üretimi bu prosedürde trombüs oluşumu için çok önemlidir. Bu yöntem, pıhtı kompozisyonunu araştırmak ve trombolitik tedavileri daha fazla incelemek için kullanılabilir.
Bu işlemi takiben, tromboliz tedavisinin diğer yöntemleri uygulanabilir ve daha sonra etkinliği belirlenebilir. Trombin eklenmesi, pıhtı kompozisyonunu fibrin açısından fakirden fibrin fakirine ayarlamayı mümkün kılar ve araştırmacıların klinik olarak ilgili terapötik stratejiler geliştirmelerine olanak tanır.
