Мы хотим создать модель инсульта, которая производит тромб, похожий на образцы пациента, и реагирует на клинически значимую тромболитическую терапию. Таким образом, мы модифицируем классическую модель фототромботического инсульта и смешиваем тромбин и фотодинамический краситель бенгальская роза перед фотоактивацией. Мы рады, что эта процедура действительно создает тромбы, которые очень чувствительны к tPA-опосредованному тромболизису.
Эта модифицированная модель фототромботического инсульта, использующая очень простые хирургические процедуры с низким уровнем смертности, позволила получить очень стабильный размер и расположение инфаркта. Вы также производите смешанный сгусток крови из фибрина и тромбоцитов, который похож на сгусток крови у пациента с острым инсультом. Поэтому мы считаем, что для доклинических исследований инсульта весьма полезно разработать более эффективные тромболитические методы лечения.
Мы надеемся, что больше людей будут использовать нашу модель. Процедуру будет демонстрировать доктор Ю-Йо Сун, наш научный сотрудник в нашей группе. За 30 минут до операции подготовьте мышь, введя обезболивающее.
После обезболивания мыши выполните ущипывание пальца ноги, чтобы убедиться, что она полностью обезболина. Затем удалите волосы на левой шее и голове с помощью крема для депиляции. Поместите мышь на адаптер для мелких животных в положении лежа на спине и простерилизуйте прооперированный участок кожи, протерев его тремя чередующимися движениями повидон-йода и 70%-ного этанола.
Под препарирующим микроскопом сделайте 0,5-сантиметровый левый разрез шейки матки с помощью микроножниц и прямых щипцов примерно на 0,2 сантиметра латеральнее средней линии. Затем с помощью тонких зубчатых щипцов раздвиньте мягкие ткани и фасцию, чтобы обнажить LCCA. Затем с помощью пары тонких гладких щипцов осторожно отделите LCCA от блуждающего нерва.
Наложите постоянный шов с двойным узлом вокруг LCCA, используя шелковый шов 5-0. Переверните мышь в положение лежа и поверните носовой зажим на 15 градусов. Затем простерилизуйте прооперированную область, протирая кожу тремя чередующимися движениями бетадина и 70% этанола.
Сделайте 0,8-сантиметровый разрез на волосистой части головы с помощью микроножниц и прямых щипцов вдоль левого глаза и уха, чтобы обнажить височную мышцу. Далее делают 0,5-сантиметровый разрез по краю височной мышцы на левой теменной кости. Затем сделайте второй 0,3-сантиметровый вертикальный разрез на височной мышце и втяните мышцу, чтобы обнажить край теменной кости и чешуйчатую кость.
Обязательно визуализируйте ориентир венечного шва между лобной и теменной костями. Затем смочите череп, нанеся стерильный физиологический раствор, чтобы выявить левую MCA, и отметьте маркером проксимальную ветвь MCA на чешуйчатой кости. Аккуратно нарисуйте круг диаметром один миллиметр, окружающий отмеченную область, с помощью пневматической бормашины.
Затем истончите череп на глубину около 0,2 миллиметра, не касаясь нижней твердой мозговой оболочки. Прекратите сверление, когда останется очень тонкий слой кости. Затем смешайте раствор тромбина и бенгальской розы в зависимости от массы тела мыши и медленно введите смесь в ретроорбитальный синус с помощью иглы 31-го калибра.
Нанесите глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость. Нанесите осветитель с лазерным лучом 532 нанометра на просверленный участок на расстоянии двух дюймов в течение 20 минут. Визуализируйте освещение в проксимальной ветви MCA с помощью лазерных проекционных очков.
Через 20 минут прекратите лазерную подсветку. Сделайте на теменной кости черепа краниальное окно диаметром три миллиметра и поставьте на него покровное стекло. Затем расположите дистальный MCA под объективом с 20-кратным погружением в воду.
Пометьте циркулирующий тромбоцит путем инъекции в хвостовую вену конъюгированного антитела DyLight 488 против GP1b-бета за пять минут до визуализации. Затем ретроорбитально вводят смесь раствора тромбина и бенгальской розы. Фотоактивируйте MCA с помощью 532-нанометровой лазерной системы с лазерным лучом диаметром 10 микрометров и записывайте изображение до образования тромба.
Для введения tPA поместите животное, находящееся под наркозом, на теплую подушку с температурой 37 градусов по Цельсию. Оберните его хвост теплой влажной марлей с температурой 45 градусов по Цельсию на одну минуту в выбранный момент времени после фотоактивации. Затем вводят рекомбинантный человеческий tPA через хвостовую вену.
Введите 50% в виде болюса, а оставшиеся 50% в течение 30 минут с помощью инфузионной помпы. Чтобы контролировать мозговой кровоток, сделайте разрез средней линии на волосистой части головы с обнаженным черепом. Увлажните череп стерильным физиологическим раствором и аккуратно нанесите на него ультразвуковой гель, стараясь избегать волос или пузырьков воздуха в геле.
Контролируйте мозговой кровоток в обоих полушариях головного мозга под лазерным спекл-контрастным тепловизором в течение 10 минут. Иммунофлуоресцентное мечение показывает, что при фототромбозе на основе бенгальского розового красителя ветвь MCA была плотно упакована CD41-положительными тромбоцитами и небольшим количеством фибрина. Напротив, при тромбозе с тромбоном и бенгальской розой ветвь MCA была окклюзирована случайно смешанными тромбоцитарными и фибриновыми сгустками.
Иммуноблоттинг-анализ показал более чем двукратное увеличение отложения фибрина в ипсилатеральном полушарии при фототромбозе тромбина и бенгальской розы по сравнению с монохромом бенгальской розы. Прижизненная визуализация с помощью конфокального микроскопа показала, что внутривенная инъекция тромбина не индуцирует агрегаты тромбоцитов даже при лазерном освещении. Тромбоциты образовывали однородные сгустки в модели фототромбоза бенгальской розы, но неравномерные агрегаты с множественными слабыми областями в модели тромбина и бенгальской розы.
CBF одной и той же мыши до и через 24 часа после tPA по сравнению с лечением транспортным средством измеряли с помощью лазерной спекл-контрастной визуализации и нормировали к контралатеральному полушарию. При бенгальском фототромбозе розы лечение ТПА приводило к тенденции к восстановлению КБФ, особенно в области границы ишемии по сравнению с мышами, получавшими лечение транспортным средством. При тромбиновом и бенгальском фототромбозе восстановление КБФ у мышей, получавших tPA, было более заметным, а проксимальные ветви MCA часто становились видимыми через 24 часа.
При бенгальском фототромбозе розы инфаркт аналогичного размера был обнаружен у мышей, получавших транспортное средство и tPA. В отличие от этого, при тромбине и бенгальском фототромбозе бенгальская роза литическое лечение tPA значительно снижало инфаркт через 0,5, один или два часа, но не через шесть часов после фотоактивации по сравнению с мышами, получавшими транспортное средство, тромбин-опосредованная генерация фибрина имеет решающее значение для образования тромба в этой процедуре. Этот метод может быть использован для исследования состава сгустков и дальнейшего изучения тромболитических методов лечения.
После этой процедуры могут быть применены другие методы тромболизисной терапии и определена их дальнейшая эффективность. Добавление тромбина позволяет регулировать состав сгустка от бедного фибрином до богатого фибрином, что позволяет исследователям разрабатывать клинически значимые терапевтические стратегии.
