Vogliamo creare un modello di ictus che produca coaguli di sangue simili ai campioni dei pazienti e risponda alla terapia trombolitica clinicamente rilevante. Pertanto, modifichiamo il classico modello di ictus fototrombotico e mescoliamo la trombina e il colorante fotodinamico rosa bengala prima della fotoattivazione. Siamo lieti che questa procedura crei effettivamente coaguli di sangue altamente sensibili alla trombolisi mediata da tPA.
Questo modello di ictus fototrombotico modificato, che utilizza procedure chirurgiche molto semplici con un basso tasso di mortalità, ha prodotto dimensioni e posizione dell'infarto altamente coerenti. Si produce anche un coagulo di sangue misto di fibrina e piastrine che sono simili a quelli del paziente con ictus acuto. Pertanto, pensiamo che sia molto utile per la ricerca preclinica sull'ictus sviluppare terapie trombolitiche più efficaci.
Speriamo che più persone utilizzino il nostro modello. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Yu-Yo Sun, il nostro assistente professore di ricerca nel nostro gruppo. 30 minuti prima dell'intervento, preparare il topo iniettando un analgesico.
Dopo aver anestetizzato il topo, eseguire un pizzicotto del dito del piede per assicurarsi che sia completamente anestetizzato. Quindi rimuovere i peli sul collo sinistro e sulla testa con una crema depilatoria. Posizionare il mouse sull'adattatore per animali di piccola taglia in posizione supina e sterilizzare l'area cutanea chirurgica pulendola con tre passaggi alternati di iodio povidone ed etanolo al 70%.
Sotto un microscopio da dissezione, praticare un'incisione cervicale sinistra di 0,5 centimetri utilizzando un paio di microforbici e una pinza diritta a circa 0,2 centimetri lateralmente alla linea mediana. Successivamente, utilizzando un paio di pinze seghettate fini, separare i tessuti molli e la fascia per esporre l'LCCA. Quindi, utilizzando un paio di pinze fini e lisce, separare con cura l'LCCA dal nervo vagale.
Posizionare una sutura permanente a doppio nodo attorno all'LCCA utilizzando una sutura di seta 5-0. Capovolgi il mouse in posizione prona e ruota il rotolo della clip del naso di 15 gradi. Quindi sterilizzare l'area chirurgica strofinando la pelle con tre passaggi alternati di Betadine ed etanolo al 70%.
Fai un'incisione di 0,8 centimetri nel cuoio capelluto usando un paio di micro forbici e una pinza dritta lungo l'occhio sinistro e l'orecchio per esporre il muscolo temporale. Successivamente, praticare un'incisione di 0,5 centimetri lungo il bordo del muscolo temporale sull'osso parietale sinistro. Quindi eseguire una seconda incisione verticale di 0,3 centimetri sul muscolo temporale e ritrarre il muscolo per esporre il bordo dell'osso parietale e dell'osso squamoso.
Assicurati di visualizzare il punto di riferimento della sutura coronale tra le ossa frontali e parietali. Successivamente, inumidisci il cranio applicando soluzione fisiologica sterile per rivelare l'MCA sinistro e segna il ramo prossimale dell'MCA sull'osso squamoso con un pennarello. Disegna delicatamente un cerchio di un millimetro di diametro che circonda quest'area contrassegnata con un trapano dentale pneumatico.
Quindi assottigliare il cranio a circa 0,2 millimetri di profondità senza toccare la dura sottostante. Interrompere la perforazione quando rimane uno strato molto sottile di osso. Successivamente, mescolare la soluzione di trombina e rosa bengala in base al peso corporeo del topo e iniettare lentamente la miscela nel seno retroorbitale con un ago calibro 31.
Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza. Applicare l'illuminatore con una luce laser a 532 nanometri sul sito perforato entro una distanza di due pollici per 20 minuti. Visualizza l'illuminazione sul ramo prossimale dell'MCA attraverso occhiali a proiezione laser.
Dopo 20 minuti, interrompere l'illuminazione laser. Fai una finestra cranica di tre millimetri di diametro sull'osso parietale del cranio e posiziona un vetro di copertura su di essa. Quindi posizionare l'MCA distale sotto una lente dell'obiettivo a immersione in acqua 20x.
Etichettare la piastrina circolante mediante iniezione nella vena caudale dell'anticorpo coniugato anti-GP1b-beta DyLight 488 cinque minuti prima dell'imaging. Quindi iniettare retroorbitalmente la miscela di soluzione di trombina e rosa bengala. Fotoattivare l'MCA utilizzando un sistema laser a 532 nanometri con un raggio laser di 10 micrometri di diametro e registrare l'immagine fino alla formazione di trombi.
Per la somministrazione di tPA, posizionare l'animale anestetizzato su un tampone caldo a 37 gradi Celsius. Avvolgere la coda con una garza bagnata calda a 45 gradi Celsius per un minuto nel punto di tempo post-fotoattivazione selezionato. Successivamente, iniettare il tPA umano ricombinante attraverso la vena caudale.
Iniettare il 50% in bolo e infondere il restante 50% per 30 minuti utilizzando una pompa per infusione. Per monitorare il flusso sanguigno cerebrale, praticare un'incisione sulla linea mediana del cuoio capelluto con il cranio esposto. Idratare il cranio con soluzione fisiologica sterile e applicare delicatamente il gel per ultrasuoni su di esso, assicurandosi di evitare capelli o bolle d'aria nel gel.
Monitorare il flusso sanguigno cerebrale in entrambi gli emisferi cerebrali con l'imager a contrasto laser speckle per 10 minuti. La marcatura a immunofluorescenza mostra che nella fototrombosi basata sul colorante del Bengala rosa, il ramo MCA era densamente imballato con piastrine CD41-positive e poca fibrina. Al contrario, nella fototrombosi trombina più rosa bengala, il ramo MCA è stato occluso da coaguli di piastrine e fibrina mescolati in modo casuale.
L'analisi di immunoblotting ha mostrato un aumento più che doppio della deposizione di fibrina nell'emisfero omolaterale nella fototrombosi del bengala rosa più rosa rispetto al solo bengala rosa. L'imaging intravitale basato su microscopio confocale ha mostrato che un'iniezione endovenosa di trombina non è riuscita a indurre aggregati piastrinici, anche sotto l'illuminazione laser. Le piastrine formavano coaguli omogenei nel modello di fototrombosi del Bengala rosa, ma aggregati irregolari con più regioni deboli nel modello di trombina più bengala rosa.
Il CBF dello stesso topo prima e 24 ore dopo il trattamento con tPA rispetto al veicolo è stato misurato mediante imaging con contrasto laser speckle e normalizzato all'emisfero controlaterale. Nella fototrombosi del Bengala rosa, il trattamento con tPA ha portato a una tendenza al recupero del CBF, in particolare nell'area di confine ischemica rispetto ai topi trattati con veicolo. Nella fototrombosi trombina più rosa bengala, il recupero del CBF nei topi trattati con tPA era più prominente e i rami prossimali di MCA diventavano spesso visibili a 24 ore.
Nella fototrombosi del Bengala rosa, una dimensione dell'infarto simile è stata rilevata nei topi trattati con veicolo e trattati con tPA. Al contrario, nella fototrombosi trombina più rosa bengala, il trattamento litico tPA ha ridotto significativamente l'infarto a 0,5, una o due ore, ma non a sei ore dopo la fotoattivazione rispetto ai topi trattati con veicolo, la generazione di fibrina mediata da trombina è cruciale per la formazione di trombi in questa procedura. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la composizione del coagulo e per studiare ulteriormente i trattamenti trombolitici.
A seguito di questa procedura, è possibile applicare altri metodi di terapia trombolitica e determinare l'efficacia successiva. L'aggiunta di trombina consente di regolare la composizione del coagulo da povera di fibrina a ricca di fibrina, consentendo ai ricercatori di sviluppare strategie terapeutiche clinicamente rilevanti.
