הפרוטוקול המוצג משמש לסינון וניתוח נכון של מועמדים ביו-אקטיביים במוצרים טבעיים לשליטה בביופילמים אוראליים. זה יכול להיות מותאם גם עבור יישומים בתחומים אחרים מחקר biofilm. שיטת סינון וניתוח עמילן זו מאפשרת להסיר רכיבים ביו-אקטיביים בו-זמנית.
עששת שיניים היא דיאטה biofilm נגזר, נפוץ מאוד, מחלה כרונית. פרוטוקול זה יכול לעזור לזהות מוצרים טבעיים כדי לשלוט biofilms וכתוצאה מכך, עששת שיניים. התחל על ידי הכנת ממס החילוץ עם תערובת הידרואלקוהולית.
אתה מדגם ריכוזים בין 50 ל 100 מיליגרם למיליליטר של ממס החילוץ ולבצע 15 דקות אולטרסאונד סייע עקירות microtubes. חזור על החילוץ שלוש פעמים. לאחר כל שלב החילוץ, צנטריפוגה המדגם כדי לתמצת את שאריות מוצק ולהסיר את supernatant.
לשלב את supernatants מכל שלב החילוץ ולסנן אותם. שמור את aliquots לניתוח כימי bioassays. עבור שבר, לדלל את מדגם תמצית גולמית כדי להשיג פתרון 100 מיליגרם למיליליטר, באמצעות ממס החילוץ הראשוני.
לאחר מכן, להעביר מיליליטר אחד של מדגם זה מחסנית מיצוי שלב מוצק מותנה מראש עם גרם אחד של סופג, וקיבולת של שישה מיליליטר. בצע שבר, באמצעות סביב שלושה כרכים מתים של כל חילוץ LUN, ולאסוף שבר אחד על ידי הרכב LUN. שמור aliquots לניתוח כימי bioassays.
הסר את הממס תחת ואקום, זרימת חנקן, או lyophilization, ולרשום את המשקל ואת התשואה. לשקם את החומר היבש עם הממסים הטובים ביותר האפשריים. חשב את ריכוז הממס עבור פתרון המניה, באמצעות הנוסחה בכתב היד של הטקסט.
הפעל מחדש את הזן המיקרוביאלי של S.mutans UA 159 על אגר דם, ותרבות אותו במדיום תרבות נוזלית. בצע דילול של אחד עד 20 של התרבות הראשונית באמצעות אותו מדיום תרבות, ו הדגירה אותו עד שהוא מגיע לשלב הצמיחה באמצע יומן. הכינו את האינוקולום עם אוכלוסייה מוגדרת ב- TYEG למטענים אנטי-מיקרוביאליים ו- TYE עם 1% סוכרוז למטעני ביופילם.
לפעילות אנטי-מיקרוביאלית, הגדירו את ריכוז המדגם לניתוח, והוסיפו אותו לצלחת של 96 באר. כלול ערכת פקדים בכל לוח, כמתואר בכתב היד של הטקסט. באמצעות TYEG, כוונן את עוצמת הקול ל-100 מיקרוליטרים, חסן 100 מיקרוליטרים של תרבות מיקרוביאלית, והדגיר את הלוח במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני.
לנתח את הצמיחה החיידקית על פי עכירות על ידי בדיקה חזותית של בארות. לחסן aliquot של הדילול הרצוי בצלחות אגר ספציפיות כפילויות, ולהדגיר את הצלחות. לאחר הדגירה, לבצע ספירת מושבה.
לשקול חרוזי הידרוקסיאפטיט במיקרו-צינורות ולחטא אותם. לאחר מכן לשטוף את החרוזים, באמצעות מאגר ספיחה Ab.Add 500 מיקרוליטרים של רוק לתוך microtubes כדי ליצור סרט רוק, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 24 סיבובים לדקה במשך 40 דקות. הסר את הרוק supernatant ולשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם Ab להכין אותם מבחנים במורד הזרם.
מוסיפים 500 מיקרוליטרים של המדגם או את הפקד לתוך כל צינור המכיל חרוזים עם גלולות רוק, ולהדגיר אותם ב 24 סיבובים לדקה ו 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם Ab.Add 500 microliters של תרבות מיקרוביאלית לכל microtube, ולהדגיר את הצינורות בתנאים דומים במשך שעה אחת. לאחר מכן שטפו את התאים הלא מאוגדים שלוש פעמים עם מאגר Ab.
התחדשו בכל דגימה עם מיליליטר אחד של מאגר Ab, וסנטיקאדה בשבעה וואט למשך 30 שניות. לדלל באופן סדרתי aliquots של כל השעיה, פי עשרה, צלחת אותם על צלחות אגר ספציפיות. דגירה הצלחות במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני, ולספור את המושבות.
לניתוח נתונים, הזן את הנתונים הגולמיים עבור bioassays לתוך גיליון אלקטרוני, ולחשב את היומן של עיכוב צמיחה מיקרוביאלית על ידי כל טיפול, ואת אחוז יומן של עיכוב צמיחה מיקרוביאלית, לעומת הפקד. לתקן את הצפיפות האופטית של הקריאות, ולחשב את אחוז עיכוב ביומסה. הפרופיל הכימי של הקרנה ביולוגית לכמות של דיטרפנים מסוג קלרודן ופלבנואידים גליקוסיליים בשלושה סוגים של תמציות C.sylvestris, כלומר סילבסטריס, ביניים, ולינגואה, מוצגים כאן.
לאחר ניתוח הנתונים הגולמיים, ארבע תמציות הראו תגובה חיובית. הנתונים הכרומטוגרפיים של ארבע תמציות אלה מראים את הנוכחות הסימולטנית של דיטרפנים מסוג קלרודן ופלבנואידים גליקוסיליים. בנוסף, הם כוללים את אותו biome ומגוון.
אחוז מחושב CFU של תאים פלנקטוניים שטופלו, ביומסה אחוז של biofilms שטופלו, ו אחוז CFU של הביופילם שטופלו מוצגים כאן. אין תמצית גולמית השפיעה באופן משמעותי על הסרת תאי S.mutans דבק גלולות הרוק. הדבקה של תאי S.mutans למטריצה גלוקנית נחלשה על ידי שלוש תמציות גולמיות.
מכיוון שכל מין צמחי דורש שיטות ניתוח כימיות ממוטבות וספציפיות, יש לבחור את שבר הממס הטוב ביותר ואת השיטה האנליטית מדוחות קודמים או להגדירם על ידי תכנון ניסיוני. זה קריטי כדי להכין ניסוחים עם תמצית גולמית הפעילה ביותר שברים ולבדוק אותם על מודלים מורכבים כדי למנוע התפתחות של biofilms וחללים.
