DPP להשפיע על גורל התא על ידי קולטני קשירה ושליחת אות תאיים כדי להשפיע על שעתוק. אם DPP מיוצר אך לא שוחרר, אין לו גישה לקולטנים ולכן אינו יכול לבצע את תפקידיו. טכניקה זו מאפשרת לדמיין שחרור DPP המאפשר לחוקרים לבחון אילו גורמים גנטיים וסביבתיים משנים את דינמיקת שחרור DPP.
מסלול האיתות של BMP שמור מזבובים לבני אדם ולכן אנו מצפים כי המנגנון המכתיב שחרור DPP יהיה רלוונטי גם להתפתחות אנושית והתחדשות. התחל על ידי חציית 30 עד 40 בתולה נקבה DPP GAL4 זבובים עם 10 עד 15 זבובים זכר UAS DPP-GFP. לעודד הטלת ביצים על ידי הוספת כמות קטנה של משחת שמרים לבקבוקון טרי של מזון.
כדי לאסוף את הביצים, להפוך את הזבובים המוצלבים לתוך הבקבוקון ולאפשר להם להטיל במשך שלוש עד ארבע שעות לפני הסרתם. שמור את בקבוקוני איסוף הביצים ב 25 מעלות צלזיוס במשך כ 144 שעות עד הזחלים נמצאים בשלב instar השלישי. לאחר מכן בחרו את הזחלים המתאימים לפירוק.
ראשית, לבחור זחלים שאינם שחפת אשר יהיה אורך נורמלי ולא קצר ושומן. כדי לבחור את ה- DPP-GFP המבטא זחלים, הצג אותם תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי. כל הזחלים שאינם TB יהיו קצת פלואורסצנטיות, אבל GFP מוגבל דיסקי הכנף והוא פחות בהיר על הזחלים DPP-GFP.
הכן מדיה HL3 שונה על פי הוראות כתב יד אשר ישמור על דיסקי הכנף בחיים להדמיה. התאם את ה- pH ל- 7.1 באמצעות HEPES ולאחר מכן סנן אותו באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22. מקם שתי חתיכות של רוחב סרט דו-צדדי חסר צבע לאורך שקופית מיקרוסקופ והשאיר רווח של כ-5 מילימטרים ביניהן וודא שקצוות הקלטת סמוקים עם קצות השקופית.
השתמש בקצה שטוח כדי ללחוץ היטב על הקלטת לשקופית. הוסף 25 מיקרוליטרים של מדיה HL3 שונה בין שתי חתיכות של קלטת. כאשר דיסק הכנף מותקן במדיה, פיסות הקלטת ימנעו ממנו להימחץ על ידי העטיפה.
כדי לנתח את הזחל, מקם אותו במדיה HL3 שונה בעדינות לקרוע אותו לשניים באמצעות שני זוגות של מדפים. השלך את החצי האחורי, ואז לתפוס את אמצע המחצית הראשונה עם זוג אחד של ממטרות ולהשתמש בזוג השני כדי לדחוף את ווים הפה בחזרה לתוך הזחל עד שהוא הפוך לחלוטין. חפש את העיקולים החדים בשני הענפים הראשיים בצבע כהה יותר של קנה הנשימה כי לרוץ במורד שני צידי הזחל.
דיסקי הכנף נמצאים ממש מתחת. הסר בעדינות את הדיסקים והכניס אותם למדיית HL3 בשקופית המוכנה כדי לוודא שאף פיסות קנה הנשימה עדיין מחוברות לדיסקים. מסדרים את דיסקי הכנף כך שהצד הקדמוני של כיס הכנף פונה כלפי מעלה כשהדיסק מונח שטוח.
מכסים את הכנף עם כיסוי וחותמים עם לק. לאחר הלק יבש, מיד להמשיך עם הדמיה. תמונה דיסק הכנף רכוב באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם מטרה שמן 40X לייזר 488 ננומטר.
לאסוף תמונות במהירות של שני הרץ במשך שתי דקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הגדר את כוח הלייזר חזק מספיק כדי לקבל תמונה ברורה של התאים משחררי DPP כדי למנוע הלבנת יתר. לאסוף את התמונות כסדרת זמן ולייצא אותם כקבצי AVI כדי לקבל וידאו של שחרור DPP.
כאשר הפרוטוקול מצליח, DPP-GFP מופיע כפס במרכז דיסק הכנף עם גרעינים הנראים כעיגולים שאינם פלואורסצנטיים. שחרור DPP-GFP גלוי כנקב פלואורסצנטי המופיעים ונעלמים הן פנימה והן הרחק מגופי התא. הפנצטה המובהק עשויה להיות בצייטונים או בסינאפסות ציטונס.
דיסקי הכנף מותקנים כך שההדמיה נעשית מהצד הקרדיאלי. אם דיסק הכנף הוא בתמונה מהצד ההפוך, פלואורסצנטיות DPP-GFP יופיע מחוץ לפוקוס והרזולוציה תהיה ירודה. כאשר GFP אינו מותך DPP, אין puncta מחוץ לגופי התא נצפו.
פקד זה מדגים כי DPP-GFP מתנהג בצורה שונה מאשר GFP בלבד. יתר על כן, אין פנצטה פלואורסצנטי להופיע כאשר DPP-GFP אינו בא לידי ביטוי. במהלך הליך זה, חשוב כי דיסק הכנף נטען צד peripodial למעלה.
אם דיסק הכנף אינו מונחה כראוי, DPP-GFP יופיע מחוץ לפוקוס. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את שחרורו של ליגנדים איתות התפתחותי אחרים כמו wingless או קיפוד. אנו יכולים לחקור את כל הגורמים הסביבתיים והגנטיים השונים שעשויים להשפיע על שחרור DPP.
בנוסף, אנו יכולים להתאים שיטה זו כדי ללמוד שחרור BMP מסוגי תאים אחרים.
