ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

השיטה פותחה כדי להקל על העשרה וזיהוי של חיידק חדשני של עניין נמצא נמטודות Caenorhabditis פראי, המאפשר חקירה נוספת לתוך אינטראקציות חיידקים מארח. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא מאפשרת לחוקרים להעשיר עבור פתוגנים בלתי ניתנים לתחזוקה וחיידקי מיקרוביום ישירות במעי של נמטודות בר. התחל על ידי השגת זן Caenorhabditis פראי של נמטודות עם חיידק בלתי ניתן לתקלה של עניין וגידול התולעים על מדיום צמיחה נמטודה סטנדרטי או לוחות NGM המכיל OP51 Escherichia coli כמקור מזון.

לדגור את הנמטודות במשך ארבעה עד חמישה ימים ב 20 מעלות צלזיוס עד כל OP51 Escherichia קולי הוא נצרך ורוב התולעים הגיעו לשלב דאואר. כדי לשטוף את הנמטודות בשלב דאואר, הוסיפו חמישה מיליליטרים של מלחים מינימליים M9 לצלחת של 6 ס"מ של תולעים מורעבות והשתמשו בצינור זכוכית סטרילי ונורה כדי להזרים את המדיה והתולעים M9 מהצלחת ולהעביר אותם לצינור צנטריפוגה סטריליטר 15 מיליליטר. לסובב את התולעים ב 1, 000 פעמים G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את M9 supernatant מעל גלולה של תולעים באמצעות פיפטה סטרילית 15 מיליליטר מבלי להפריע לתולעים החיות על ידי השארת כ 50 microliters של M9 מעל התולעים.

לאותה צינור צנטריפוגה, הוסיפו 10 מיליליטר של מדיית M9 המכילים 0.05% מטריטון X-100 והידקו כראוי את מכסה הצינור לפני הנחת הצינור על Nutator בטמפרטורת החדר כדי להסיר את החיידקים החיצוניים. לאחר 20 דקות של דגירה על Nutator, לסובב את התולעים ב 1, 000 פעמים G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר ולהשליך את M9 supernatant כפי שהודגם ולחזור על הליך הכביסה שלוש פעמים עם מדיה M9 המכיל 0.05% של Triton X-100. לאחר מכן, לדגור על הצינור המכיל נמטודות לילה על Nutator בטמפרטורת החדר על ידי הוספת פתרון אנטיביוטיקה ו- SDS שהוכן טרי.

לאחר הטיפול באנטיביוטיקה, לסובב את התולעים בצינור ב 1, 000 פעמים G במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant לפני הוספת 10 מיליליטר של M9 המכיל 0.05%טריטון X-100 ולהדק כראוי את המכסה כדי לדגור על הצינור על Nutator במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סיום, לסובב את התולעים ב 1, 000 פעמים G במשך דקה אחת ולחזור על הליך זה שלוש פעמים.

לאחר השטיפה הרביעית עם M9 המכיל 0.05%Triton X-100, להשאיר את גלולה התולעת ללא הפרעה ב 100 microliters של הפתרון ולהשליך את השאר. העבר 100 מיקרוליטרים של supernatant ואת הכדור למרכז של צלחת NGM 10 ס"מ זרע עם OP51 Escherichia coli. אפשר לרמה להתייבש באין מפריע בזמן שהדאורים זוחלים החוצה מהמרכז ודרך מדשאת OP51 במשך 5 עד 10 דקות.

הרימו בזהירות דאואר אחד ופתחו אותו על צלחת NGM של שישה ס"מ עם OP51. באותו אופן, רמת לפחות 10 Dauers בלוחות בודדים שישה סנטימטרים NGM זרע עם OP51. לדגור על הצלחות במשך ארבעה עד חמישה ימים ב 20 מעלות צלזיוס עד דאואר גדל ואת הדור הבא F1s הגיע לשלב הבוגרים, ולאחר מכן לבדוק חזותית לזיהום על כל הצלחות.

עבור כל צלחת נקייה, לאמת את התפשטות המיקרואורגניזם של עניין באמצעות נומרסקי או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהתאם פנוטיפ של עניין. להרעבת התולעים ולצמצום מספר חיידקי OP51, דגירה על הנמטודות ב-20 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים. הוסף חמישה מיליליטר של התקשורת M9 לצלחת של תולעים מורעבות לאחרונה ולאחר מכן להעביר את התקשורת M9 ותולעים צינור צנטריפוגה סטרילי 15 מילימטר להסתובב למטה ב 1, 000 פעמים G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.

הסר את supernatant לפני שטיפת התולעים חמש פעמים עם 10 מיליליטר של M9 המכיל 0.05%טריטון X-100 על Nutator במשך 20 דקות. לאחר השטיפה האחרונה, להסיר את supernatant מבלי להפריע לכדור ב 100 microliters של הפתרון ולהעביר את M9 ואת התולעים לצלחת NGM שישה סנטימטרים לא מנוצל. תן את הצלחת להתייבש בעוד התולעים לזחול סביב במשך 20 דקות כדי לעזור להסיר OP51 מן הקיטור והמעי.

כאשר הצלחת יבשה, חזור על ההליך על ידי הוספת 250 מיקרוליטרים של M9 והעברת התולעים ללוח חדש של שישה סנטימטרים NGM כדי לאפשר לתולעים לזחול בזמן שהצלחת מתייבשת. לאחר 20 דקות, להוסיף 250 microliters של M9 לצלחת ולהעביר 100 microliters של M9 יחד עם תולעים לזכוכית שעון נקי, ולאחר מכן לערוף את הנמטודות באמצעות מחט מזרק 26 מד תוך החזקת התולעת למטה עם מחט מזרק 26 מד נוסף. לאחר עריפת ראשם, המעי, המסה הגרעינית, ואת gonad שקוף באופן טבעי למנוע מגוף נמטודה, ואז לחתוך חתיכה של המעי החשוף ולהעביר מעי ניתח יחיד לתוך צינור PCR 0.5 מיליליטר המכיל 10 microliters של מים סטריליים.

חזור על ההליך כדי לאסוף מעיים מלפחות חמש חיות שונות בצינורות PCR. להקפיא את צינורות PCR במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך מינימום של חמש דקות. להפשיר את דגימות המעי לפני שתמשיך עם PCR ורצף לזיהוי.

זן טרופי של Caenorhabditis בר JU1848 נמצא שיש לו חיידקים דקים שהתיישבו בלומן של המעי בצורה כיוונית. זן הבר JU1848 הפיץ צמיחה מיקרוביאלית ניכרת על לוחות NGM סטנדרטיים של שישה ס"מ שנזרעו בחיידקי Escherichia coli OP51. לאחר הניקוי, צלחת של צאצאי F1 מדאואר יחיד לא הראתה זיהום מיקרוביאלי גלוי לאחר ארבעה ימים של דגירה.

בתמונת נומרסקי של חיה JU1848 ערופה, החיידקים המתיישבים נראו בלומן של פיסת המעי שנמצאת מחוץ לגוף הנמטודה. כמה מינים Caenorhabditis עשוי לדרוש ריכוז SDS נמוך יותר כדי למנוע מוות דאואר. כדי להפיץ זן נמטודה נקי, בחר דאוארים שזחלו הכי רחוק מהמרכז כמו זחילה מסייעת להסיר מזהמים ששרדו.