Il metodo è stato sviluppato per facilitare l'arricchimento e l'identificazione di un nuovo microbo di interesse trovato nei nematodi selvatici della Caenorhabditis, consentendo ulteriori indagini sulle interazioni dei microbi ospiti. Il vantaggio principale della tecnica è che consente ai ricercatori di arricchire patogeni non coltivabili e batteri del microbioma direttamente nell'intestino dei nematodi selvatici. Inizia ottenendo il ceppo selvatico di nematodi Caenorhabditis con un microbo incolturabile di interesse e facendo crescere i vermi su un mezzo di crescita nematode standard o piastre NGM contenenti OP51 Escherichia coli come fonte di cibo.
Incubare i nematodi per quattro o cinque giorni a 20 gradi Celsius fino a quando tutto l'OP51 Escherichia coli viene consumato e la maggior parte dei vermi ha raggiunto lo stadio Dauer. Per lavare i nematodi nella fase Dauer, aggiungere cinque millilitri di mezzi sali minimi M9 a una piastra di sei centimetri di vermi affamati e utilizzare una pipetta di vetro sterile e una lampadina per pipettare il supporto M9 e i vermi dalla piastra e trasferirli in un tubo sterile da 15 millilitri per centrifuga. Abbassare i vermi a 1.000 volte G per 30 secondi a temperatura ambiente, quindi rimuovere e scartare il surnatante M9 sopra il pellet di vermi usando una pipetta sterile da 15 millilitri senza disturbare i vermi vivi lasciando circa 50 microlitri di M9 sopra i vermi.
Allo stesso tubo della centrifuga, aggiungere 10 millilitri del supporto M9 contenente lo 0,05% di Triton X-100 e stringere adeguatamente il cappuccio del tubo prima di posizionare il tubo su un Nutator a temperatura ambiente per rimuovere i microbi esterni. Dopo 20 minuti di incubazione sul Nutator, abbassare i vermi a 1.000 volte G per 30 secondi a temperatura ambiente, quindi rimuovere e scartare il surnatante M9 come dimostrato e ripetere la procedura di lavaggio tre volte con il mezzo M9 contenente lo 0,05% di Triton X-100. Quindi, incubare il tubo contenente nematodi durante la notte su un Nutator a temperatura ambiente aggiungendo l'antibiotico appena preparato e la soluzione SDS.
Dopo il trattamento con antibiotico, far girare i vermi nel tubo a 1.000 volte G per un minuto a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante prima di aggiungere 10 millilitri di M9 contenenti lo 0,05% di Triton X-100 e stringere adeguatamente il cappuccio per incubare il tubo su un Nutator per 20 minuti a temperatura ambiente. Una volta fatto, abbassare i vermi a 1.000 volte G per un minuto e ripetere questa procedura tre volte.
Dopo il quarto lavaggio con l'M9 contenente lo 0,05% di Triton X-100, lasciare indisturbato il pellet di verme in 100 microlitri della soluzione e scartare il resto. Trasferire 100 microlitri del surnatante e del pellet al centro di una piastra NGM di 10 centimetri seminata con OP51 Escherichia coli. Lasciare asciugare indisturbato il piatto mentre i Dauer strisciano fuori dal centro e attraverso il prato OP51 per 5-10 minuti.
Prelevare con cura un singolo Dauer e placcarlo su una piastra NGM di sei centimetri seminata con OP51. Allo stesso modo, placcare almeno 10 Dauers in singole piastre NGM di sei centimetri seminate con OP51. Incubare le piastre per quattro o cinque giorni a 20 gradi Celsius fino a quando i Dauers non sono cresciuti e le F1 della generazione successiva hanno raggiunto lo stadio adulto, quindi controllare visivamente la contaminazione su tutte le piastre.
Per ogni piastra pulita, verificare la propagazione del microbo di interesse tramite Nomarski o microscopia fluorescente a seconda del fenotipo di interesse. Per affamare i vermi e ridurre il numero di batteri OP51, incubare i nematodi a 20 gradi Celsius per tre o quattro giorni. Aggiungere cinque millilitri del supporto M9 alla piastra di vermi recentemente affamati e quindi trasferire il mezzo M9 e i vermi in un tubo centrifugo sterile da 15 millimetri per girare a 1.000 volte G per 30 secondi a temperatura ambiente.
Rimuovere il surnatante prima di lavare i vermi cinque volte con 10 millilitri di M9 contenenti lo 0,05% di Triton X-100 su un Nutator per 20 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet in 100 microlitri della soluzione e trasferire l'M9 e i vermi in una piastra NGM di sei centimetri senza semi. Lasciare asciugare la piastra mentre i vermi strisciano per 20 minuti per aiutare a rimuovere OP51 dalla cuticola e dall'intestino.
Quando la piastra è asciutta, ripetere la procedura aggiungendo 250 microlitri dell'M9 e trasferendo i vermi su una nuova piastra NGM da sei centimetri senza semi per consentire ai vermi di strisciare mentre la piastra si asciuga. Dopo 20 minuti, aggiungere 250 microlitri dell'M9 alla piastra e trasferire 100 microlitri dell'M9 insieme ai vermi in un vetro dell'orologio pulito, quindi decapitare i nematodi usando un ago a siringa calibro 26 tenendo premuto il verme con un altro ago per siringa calibro 26. Una volta decapitato, l'intestino, una massa granulare e la gonade trasparente si allontaneranno naturalmente dal corpo del nematode, quindi taglieranno un pezzo dell'intestino esposto e trasferiranno un singolo intestino sezionato in un tubo PCR da 0,5 millilitri contenente 10 microlitri di acqua sterile.
Ripetere la procedura per raccogliere l'intestino da almeno cinque animali diversi in tubi PCR. Congelare i tubi PCR a meno 80 gradi Celsius per un minimo di cinque minuti. Scongelare i campioni intestinali prima di procedere con la PCR e il sequenziamento per l'identificazione.
Un ceppo selvatico di Caenorhabditis tropicalis JU1848 è stato trovato con microbi sottili che colonizzavano il lume dell'intestino in modo direzionale. Il ceppo selvatico JU1848 ha propagato una notevole crescita microbica su piastre NGM standard di sei centimetri seminate con batteri Escherichia coli OP51. Dopo la pulizia, una piastra di progenie F1 di un singolo Dauer non ha mostrato alcuna contaminazione microbica visibile dopo quattro giorni di incubazione.
Nell'immagine di Nomarski di un animale JU1848 decapitato, i batteri colonizzatori erano visibili nel lume di un pezzo dell'intestino che si trova al di fuori del corpo del nematode. Alcune specie di Caenorhabditis possono richiedere una concentrazione di SDS inferiore per prevenire la morte di Dauer. Per propagare un ceppo di nematode pulito, scegli i Dauer che strisciano più lontano dal centro poiché strisciare aiuta a rimuovere i contaminanti sopravvissuti.
