Die Methode wurde entwickelt, um die Anreicherung und Identifizierung einer neuartigen Mikrobe von Interesse zu erleichtern, die in wilden Caenorhabditis-Nematoden gefunden wird, was eine weitere Untersuchung der Wirtsmikrobeninteraktionen ermöglicht. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, sich für nicht kultivierbare Krankheitserreger und Mikrobiombakterien direkt im Darm von wilden Nematoden anzureichern. Beginnen Sie mit der Gewinnung des wilden Caenorhabditis-Stammes von Nematoden mit einer unkulturierbaren Mikrobe von Interesse und züchten Sie die Würmer auf einem Standard-Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM-Platten, die OP51 Escherichia coli als Nahrungsquelle enthalten.
Die Nematoden vier bis fünf Tage bei 20 Grad Celsius inkubieren, bis alle OP51 Escherichia coli verbraucht sind und der Großteil der Würmer das Dauerstadium erreicht hat. Um die Nematoden im Dauer-Stadium zu waschen, fügen Sie fünf Milliliter M9-Minimalsalzmedien zu einer sechs Zentimeter großen Platte mit ausgehungerten Würmern hinzu und verwenden Sie eine sterile Glaspipette und -zwiebel, um die M9-Medien und Würmer von der Platte zu pipettieren und sie in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Drehen Sie die Würmer bei 1.000 mal G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur herunter, entfernen Sie dann den M9-Überstand über dem Pellet der Würmer mit einer sterilen 15-Milliliter-Pipette, ohne die lebenden Würmer zu stören, indem Sie etwa 50 Mikroliter M9 über den Würmern belassen.
Fügen Sie in dasselbe Zentrifugenröhrchen 10 Milliliter des M9-Mediums hinzu, das 0,05% Triton X-100 enthält, und ziehen Sie die Kappe des Röhrchens ausreichend fest, bevor Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur auf einen Nutator legen, um die externen Mikroben zu entfernen. Nach 20 Minuten Inkubation auf dem Nutator die Würmer bei 1.000 mal G für 30 Sekunden bei Raumtemperatur herunterdrehen, dann den M9-Überstand wie demonstriert entfernen und verwerfen und den Waschvorgang dreimal mit dem M9-Medium wiederholen, das 0,05% Triton X-100 enthält. Als nächstes inkubieren Sie die Tube mit Nematoden über Nacht auf einem Nutator bei Raumtemperatur, indem Sie das frisch zubereitete Antibiotikum und die SDS-Lösung hinzufügen.
Nach der Behandlung mit Antibiotikum die Würmer im Röhrchen bei 1.000 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur herunterdrehen. Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie 10 Milliliter M9 mit 0,05% Triton X-100 hinzufügen, und ziehen Sie die Kappe ausreichend fest, um das Röhrchen auf einem Nutator für 20 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Sobald Sie fertig sind, drehen Sie die Würmer bei 1.000 mal G für eine Minute herunter und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
Nach der vierten Wäsche mit dem M9, der 0,05% Triton X-100 enthält, lassen Sie das Wurmpellet ungestört in 100 Mikrolitern der Lösung und entsorgen Sie den Rest. 100 Mikroliter des Überstandes und des Pellets in die Mitte einer 10 Zentimeter langen NGM-Platte geben, die mit OP51 Escherichia coli ausgesät wurde. Lassen Sie die Platte ungestört trocknen, während die Dauers 5 bis 10 Minuten aus der Mitte und durch den OP51-Rasen kriechen.
Nehmen Sie vorsichtig eine einzelne Dauer auf und legen Sie sie auf eine sechs Zentimeter lange NGM-Platte, die mit OP51 besät ist. Auf die gleiche Weise werden mindestens 10 Dauers in einzelne sechs Zentimeter große NGM-Platten mit OP51 ausgesät. Inkubieren Sie die Platten für vier bis fünf Tage bei 20 Grad Celsius, bis Dauers gewachsen sind und die nachfolgenden Generation F1s das Erwachsenenstadium erreicht haben, und überprüfen Sie dann visuell auf Verunreinigungen auf allen Platten.
Überprüfen Sie für jede saubere Platte die Ausbreitung der interessierenden Mikrobe über Nomarski oder Fluoreszenzmikroskopie, abhängig vom interessierenden Phänotyp. Um die Würmer zu verhungern und die Anzahl der OP51-Bakterien zu reduzieren, inkubieren Sie die Nematoden bei 20 Grad Celsius für drei bis vier Tage. Fügen Sie fünf Milliliter des M9-Mediums auf die Platte der kürzlich ausgehungerten Würmer und übertragen Sie dann die M9-Medien und Würmer in ein steriles 15-Millimeter-Zentrifugenröhrchen, um bei Raumtemperatur 30 Sekunden lang mit 1.000 mal G herunterzufahren.
Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie die Würmer fünfmal mit 10 Millilitern des M9 mit 0,05% Triton X-100 auf einem Nutator für 20 Minuten waschen. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den Überstand, ohne das Pellet in 100 Mikrolitern der Lösung zu stören, und geben Sie die M9 und die Würmer auf eine ungesetzte sechs Zentimeter lange NGM-Platte. Lassen Sie die Platte trocknen, während die Würmer 20 Minuten lang herumkriechen, um OP51 aus der Nagelhaut und dem Darm zu entfernen.
Wenn die Platte trocken ist, wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie 250 Mikroliter des M9 hinzufügen und die Würmer auf eine neue ungesetzte sechs Zentimeter lange NGM-Platte übertragen, damit die Würmer kriechen können, während die Platte trocknet. Nach 20 Minuten 250 Mikroliter des M9 auf die Platte geben und 100 Mikroliter des M9 zusammen mit Würmern auf ein sauberes Uhrglas übertragen, dann enthaupten Sie die Nematoden mit einer 26-Gauge-Spritzennadel, während Sie den Wurm mit einer weiteren 26-Gauge-Spritzennadel festhalten. Einmal enthauptet, werden der Darm, eine körnige Masse und die transparente Gonade auf natürliche Weise vom Nematodenkörper abgewendet, dann ein Stück des freiliegenden Darms abschneiden und einen einzelnen sezierten Darm in ein 0,5 Milliliter PCR-Röhrchen mit 10 Mikrolitern sterilem Wasser übertragen.
Wiederholen Sie den Vorgang, um Därme von mindestens fünf verschiedenen Tieren in PCR-Röhrchen zu sammeln. Die PCR-Röhren bei minus 80 Grad Celsius für mindestens fünf Minuten einfrieren. Tauen Sie die Darmproben auf, bevor Sie mit der PCR und der Sequenzierung zur Identifizierung fortfahren.
Es wurde festgestellt, dass ein wilder Caenorhabditis tropicalis-Stamm JU1848 dünne Mikroben aufweist, die das Darmlumen direktional besiedeln. Der Wildstamm JU1848 vermehrte auffälliges mikrobielles Wachstum auf Standard-Sechs-Zentimeter-NGM-Platten, die mit Escherichia coli OP51-Bakterien ausgesät waren. Nach der Reinigung zeigte eine Platte mit F1-Nachkommen aus einer einzigen Dauer nach vier tagen Inkubation keine sichtbare mikrobielle Kontamination.
Auf dem Nomarski-Bild eines enthaupteten JU1848-Tieres waren die kolonisierenden Bakterien im Lumen eines Darmstücks außerhalb des Nematodenkörpers sichtbar. Einige Caenorhabditis-Arten können eine niedrigere SDS-Konzentration erfordern, um den Dauertod zu verhindern. Um einen sauberen Nematodenstamm zu vermehren, wählen Sie Dauers, die am weitesten von der Mitte gekrochen sind, da das Krabbeln hilft, überlebende Verunreinigungen zu entfernen.
