Yöntem, vahşi Caenorhabditis nematodlarında bulunan yeni bir ilgi mikrobunun zenginleştirilmesini ve tanımlanmasını kolaylaştırmak için geliştirilmiştir ve konak mikrop etkileşimlerinin daha fazla araştırılmasına izin verir. Tekniğin ana avantajı, araştırmacıların doğrudan vahşi nematodların bağırsa sinde kült olmayan patojenler ve mikrobiyom bakterileri için zenginleştirmelerini sağlamaktır. Nematodların vahşi Caenorhabditis suşunu kültürsüz bir ilgi mikrobu ile elde ederek ve solucanları standart bir nematod büyüme ortamında veya bir besin kaynağı olarak OP51 Escherichia coli içeren NGM plakalarında büyüterek başlayın.
Tüm OP51 Escherichia coli tüketilene ve solucanların çoğu Dauer aşamasına ulaşana kadar nematodları 20 santigrat derecede dört ila beş gün kuluçkaya yatırın. Nematodları Dauer aşamasında yıkamak için, altı santimetrelik aç solucan tabağına beş mililitre M9 minimal tuz ortamı ekleyin ve M9 medyasını ve solucanlarını plakadan pipetle borulamak ve steril 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarmak için steril bir cam pipet ve ampul kullanın. Solucanları oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1.000 kez G'de döndürün, ardından solucanların üzerine yaklaşık 50 mikrolitre M9 bırakarak canlı solucanları rahatsız etmeden steril bir 15 mililitre pipet kullanarak solucanların peletinin üzerindeki M9 üstnatantını çıkarın ve atın.
Aynı santrifüj tüpüne, Triton X-100'ün % 0,05'ini içeren 10 mililitre M9 ortamı ekleyin ve harici mikropları çıkarmak için tüpü oda sıcaklığında bir Somuncuya yerleştirmeden önce tüpün kapağını yeterince sıkın. Nutator'da 20 dakika kuluçkadan sonra, solucanları oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1.000 kez G'de döndürün, ardından M9 üstnatantı gösterildiği gibi çıkarın ve atın ve Triton X-100'ün% 0.05'ini içeren M9 ortamıyla yıkama prosedürünü üç kez tekrarlayın. Daha sonra, nematod içeren tüpü, taze hazırlanmış antibiyotik ve SDS çözeltisini ekleyerek oda sıcaklığında bir Nutator üzerinde bir gecede kuluçkaya yatırın.
Antibiyotikle tedaviden sonra, tüpteki solucanları oda sıcaklığında bir dakika boyunca 1.000 kez G'de döndürün. %0,05 Triton X-100 içeren 10 mililitre M9 eklemeden önce süpernatantı çıkarın ve tüpü oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bir Nutator'da kuluçkaya yatırmak için kapağı yeterince sıkın. Tamamlandığında, solucanları bir dakika boyunca 1.000 kez G'de döndürün ve bu işlemi üç kez tekrarlayın.
M9 ile %0,05 Triton X-100 içeren dördüncü yıkamadan sonra, solucan peletini çözeltinin 100 mikrolitresinde bozulmadan bırakın ve geri kalanını atın. 100 mikrolitre süpernatant ve peletin OP51 Escherichia coli ile tohumlanmış 10 santimetre ngm plakanın ortasına aktarın. Dauers merkezden çıkarken ve OP51 çimlerinden 5 ila 10 dakika boyunca sürünürken plakanın bozulmadan kurumasını bekleyin.
Dikkatlice tek bir Dauer alın ve OP51 ile tohumlanmış altı santimetre NGM plakasına plakalayın. Aynı şekilde, OP51 ile tohumlanmış bireysel altı santimetre NGM plakalarında en az 10 Dauers plaka. Dauers büyüyene ve sonraki nesil F1'ler yetişkin aşamasına ulaşana kadar plakaları 20 santigrat derecede dört ila beş gün kuluçkaya yatırın, ardından tüm plakalarda kontaminasyon olup olmadığını görsel olarak kontrol edin.
Her temiz plaka için, ilginin fenotipine bağlı olarak Nomarski veya floresan mikroskopi ile ilgi mikrobunun yayılmasını doğrulayın. Solucanları aç bırakmak ve OP51 bakteri sayısını azaltmak için, nematodları üç ila dört gün boyunca 20 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Son zamanlarda aç kalan solucanların tabağına beş mililitre M9 ortamı ekleyin ve ardından M9 medyasını ve solucanları oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 1.000 kez G'de aşağı dönmek için steril 15 milimetre santrifüj tüpüne aktarın.
Solucanları 20 dakika boyunca bir Nutator üzerinde% 0.05 Triton X-100 içeren 10 mililitre M9 ile beş kez yıkamadan önce süpernatantı çıkarın. Son yıkamadan sonra, çözeltinin 100 mikrolitresinde peletı bozmadan süpernatantı çıkarın ve M9 ve solucanları altı santimetrelik bir NGM plakasına aktarın. Solucanlar OP51'i tiksin ve bağırsaktan çıkarmaya yardımcı olmak için 20 dakika boyunca sürünürken plakayı kurumaya bırakın.
Plaka kuruduğunda, M9'un 250 mikrolitresini ekleyerek ve solucanları yeni bir katlanmamış altı santimetre NGM plakasına aktararak prosedürü tekrarlayın, böylece plaka kururken solucanların sürünmesine izin verin. 20 dakika sonra, plakaya 250 mikrolitre M9 ekleyin ve solucanlarla birlikte M9'un 100 mikrolitresini temiz bir saat camına aktarın, ardından solucanı başka bir 26 kalibre şırınga iğnesi ile tutarken 26 kalibrelik bir şırınga iğnesi kullanarak nematodların kafasını kesin. Kafası kesildikten sonra, bağırsak, granül bir kütle ve şeffaf gonad doğal olarak nematod gövdesinden uzak duracak, daha sonra açıkta kalan bağırsağın bir parçasını kesecek ve tek bir parçalanmış bağırsağı 10 mikrolitre steril su içeren 0,5 mililitre PCR tüpüne aktaracaktır.
PCR tüplerinde en az beş farklı hayvandan bağırsak toplamak için prosedürü tekrarlayın. PCR tüplerini eksi 80 santigrat derecede en az beş dakika dondurun. PCR ile devam etmeden önce bağırsak örneklerini çözün ve tanımlama için dizilim.
Vahşi bir Caenorhabditis tropicalis suşu JU1848'in bağırsak lümenini yönlü olarak kolonize eden ince mikroplara sahip olduğu bulunmuştur. Ju1848 vahşi suşu, Escherichia coli OP51 bakterisi ile tohumlanmış standart altı santimetre NGM plakalarında gözle görülür mikrobiyal büyüme yaymıştır. Temizlikten sonra, tek bir Dauer'den bir tabak F1 progeny, dört günlük inkübasyondan sonra görünür bir mikrobiyal kontaminasyon göstermedi.
Kafası kesilmiş bir JU1848 hayvanının Nomarski görüntüsünde, kolonileşen bakteri, nematod vücudunun dışındaki bir bağırsak parçasının lümeninde görülebilirdi. Bazı Caenorhabditis türleri Dauer'in ölümünü önlemek için daha düşük bir SDS konsantrasyonu gerektirebilir. Temiz bir nematod suşu yaymak için, hayatta kalan kirleticilerin giderilmesine yardımcı olduğu için merkezden en uzağa sürünen Dauers'ı seçin.
