تم تطوير هذه الطريقة لتسهيل إثراء وتحديد ميكروب جديد للاهتمام موجود في الديدان الخيطية البرية Caenorhabditis ، مما يسمح بمزيد من التحقيق في تفاعلات الميكروبات المضيفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن الباحثين من إثراء مسببات الأمراض غير القابلة للتكريس وبكتيريا الميكروبيوم مباشرة في أمعاء النيماتودا البرية. تبدأ من خلال الحصول على سلالة Caenorhabditis البرية من الديدان الخيطية مع ميكروب غير قابل للزرع من الفائدة وزراعة الديدان على متوسط نمو النيماتودا القياسية أو لوحات NGM التي تحتوي على OP51 Escherichia coli كمصدر للغذاء.
احتضان الديدان الخيطية لمدة أربعة إلى خمسة أيام في 20 درجة مئوية حتى يتم استهلاك جميع القولونية Escherichia OP51 وغالبية الديدان وصلت إلى مرحلة داور. لغسل الديدان الخيطية في مرحلة داور، إضافة خمسة ملليلتر من M9 الحد الأدنى من الأملاح وسائل الإعلام إلى لوحة ستة سنتيمترات من الديدان الجائعة واستخدام ماصة زجاجية معقمة ولمبة ماصة تصل وسائل الإعلام M9 والديدان من لوحة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر معقمة. تدور أسفل الديدان في 1000 مرة G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة والتخلص من الناطقة M9 فوق بيليه من الديدان باستخدام ماصة معقمة 15 ملليلتر دون إزعاج الديدان الحية عن طريق ترك ما يقرب من 50 ميكرولتر من M9 فوق الديدان.
إلى نفس أنبوب الطرد المركزي، أضف 10 ملليلترات من وسائط M9 التي تحتوي على 0.05٪ من Triton X-100 وتشديد غطاء الأنبوب بشكل كاف قبل وضع الأنبوب على نوتاتور في درجة حرارة الغرفة لإزالة الميكروبات الخارجية. بعد 20 دقيقة من الحضانة على نوتاتور، تدور أسفل الديدان في 1، 000 مرة G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة والتخلص من الناسخ M9 كما هو موضح وتكرار إجراء الغسيل ثلاث مرات مع وسائل الإعلام M9 تحتوي على 0.05٪ من تريتون X-100. بعد ذلك ، احتضن الأنبوب الذي يحتوي على الديدان الخيطية بين عشية وضحاها على نوتاتور في درجة حرارة الغرفة عن طريق إضافة المضادات الحيوية الطازجة وحل SDS.
بعد العلاج بالمضادات الحيوية ، قم بتدفير الديدان في الأنبوب بمعدل 1000 مرة G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant قبل إضافة 10 ملليلتر من M9 تحتوي على 0.05٪ تريتون X-100 وتشديد الغطاء بشكل كاف لاحتضان الأنبوب على نوتاتور لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبمجرد الانتهاء من ذلك، تدور أسفل الديدان في 1،000 مرة G لمدة دقيقة واحدة وتكرار هذا الإجراء ثلاث مرات.
بعد الغسيل الرابع مع M9 التي تحتوي على 0.05٪ تريتون X-100، وترك بيليه دودة دون عائق في 100 ميكرولتر من الحل والتخلص من بقية. نقل 100 ميكرولتر من supernatant والكريهة إلى مركز لوحة NGM 10 سم المصنف مع OP51 إشريكيا القولونية. السماح للطبق لتجف دون عائق في حين أن Dauers الزحف للخروج من المركز وعبر الحديقة OP51 لمدة 5 إلى 10 دقائق.
التقط بعناية واحدة Dauer ولوحة على لوحة NGM ستة سنتيمترات بذر مع OP51. بنفس الطريقة، لوحة ما لا يقل عن 10 Dauers في لوحات فردية NGM ستة سنتيمترات المصنف مع OP51. احتضان لوحات لمدة أربعة إلى خمسة أيام في 20 درجة مئوية حتى نمت Dauers والجيل التالي F1s وصلت إلى مرحلة الكبار، ثم التحقق بصريا للتلوث على جميع لوحات.
لكل صفيحة نظيفة، تحقق من انتشار الميكروب المثير للاهتمام عبر نومارسكي أو المجهر الفلوري اعتمادا على النمط الظاهري للاهتمام. لتجويع الديدان وتقليل عدد البكتيريا OP51، واحتضان الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. أضف خمسة ملليلترات من وسائط M9 إلى لوحة الديدان الجائعة مؤخرا ثم قم بنقل وسائط M9 والديدان إلى أنبوب طرد مركزي معقم عيار 15 ملليمترا لتدور بسرعة 1000 مرة G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
إزالة supernatant قبل غسل الديدان خمس مرات مع 10 ملليلتر من M9 تحتوي على 0.05٪ تريتون X-100 على نوتاتور لمدة 20 دقيقة. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة الناسخ دون إزعاج بيليه في 100 ميكرولتر من المحلول ونقل M9 والديدان إلى لوحة غير مصنفة NGM ستة سنتيمترات. دع اللوحة تجف بينما تزحف الديدان لمدة 20 دقيقة للمساعدة في إزالة OP51 من البشرة والأمعاء.
عندما تكون اللوحة جافة، كرر الإجراء بإضافة 250 ميكرولتر من M9 ونقل الديدان إلى لوحة NGM جديدة غير مصنفة 6 سنتيمترات للسماح للديدان بالزحف أثناء جفاف اللوحة. بعد 20 دقيقة، إضافة 250 ميكرولتر من M9 إلى لوحة ونقل 100 ميكرولتر من M9 جنبا إلى جنب مع الديدان إلى زجاج ساعة نظيفة، ثم قطع رأس الديدان الخيطية باستخدام إبرة حقنة قياس 26 في حين عقد الدودة أسفل مع آخر 26 إبرة حقنة قياس. بمجرد قطع الرأس ، فإن الأمعاء ، وكتلة حبيبية ، والغناد الشفاف ستتجنب بشكل طبيعي من جسم النيماتودا ، ثم تقطع قطعة من الأمعاء المكشوفة ونقل أمعاء تشريح واحدة إلى أنبوب PCR 0.5 ملليلتر يحتوي على 10 ميكرولتر من الماء العقيم.
كرر الإجراء لجمع الأمعاء من خمسة مختلفة على الأقل في أنابيب PCR. تجميد أنابيب PCR في ناقص 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن خمس دقائق. إذابة عينات الأمعاء قبل الشروع في PCR وتسلسل لتحديد الهوية.
تم العثور على سلالة Caenorhabditis الاستوائية البرية JU1848 لديها ميكروبات رقيقة استعمرت تجويف الأمعاء بطريقة اتجاهية. نشرت السلالة البرية JU1848 نموا ميكروبيا ملحوظا على لوحات NGM القياسية التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات والمبذرة ببكتيريا الإشريكية القولونية OP51. بعد التنظيف، لم تظهر طبق من ذرية F1 من داور واحد أي تلوث ميكروبي مرئي بعد أربعة أيام من الحضانة.
في صورة نومارسكي لحيوان JU1848 مقطوع الرأس، كانت البكتيريا المستعمرة مرئية في تجويف قطعة من الأمعاء خارج جسم النيماتود. قد تتطلب بعض أنواع التهاب Caenorhabditis تركيز أقل SDS لمنع موت داور. لنشر سلالة النيماتودا النظيفة، اختر Dauers التي زحفت أبعد من المركز حيث يساعد الزحف على إزالة الملوثات الناجية.
