O método foi desenvolvido para facilitar o enriquecimento e identificação de um novo micróbio de interesse encontrado em nematoides de Caenorhabditis selvagens, permitindo uma investigação mais aprofundada sobre as interações de micróbios hospedeiros. A principal vantagem da técnica é que permite aos pesquisadores enriquecer para patógenos não culturados e bactérias microbioma diretamente no intestino de nematoides selvagens. Comece obtendo a cepa de caenorhabditis selvagem de nematoides com um micróbio incultural de interesse e crescendo os vermes em um meio de crescimento nematode padrão ou placas de NGM contendo OP51 Escherichia coli como fonte de alimento.
Incubar os nematoides por quatro a cinco dias a 20 graus Celsius até que todo o OP51 Escherichia coli seja consumido e a maioria dos vermes tenha chegado ao estágio Dauer. Para lavar os nematoides no estágio Dauer, adicione cinco mililitros de m9 de luz mínima de sais à uma placa de seis centímetros de vermes famintos e use uma pipeta de vidro estéril e uma lâmpada para espercarar a mídia M9 e vermes da placa e transferi-los para um tubo de centrífuga de 15 mililitros estéril. Gire os vermes a 1.000 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente, depois remova e descarte o supernatante M9 acima da pelota de vermes usando uma pipeta estéril de 15 mililitros sem perturbar os vermes vivos deixando aproximadamente 50 microliters de M9 acima dos vermes.
Ao mesmo tubo de centrífugas, adicione 10 mililitros da mídia M9 contendo 0,05% do Triton X-100 e aperte adequadamente a tampa do tubo antes de colocar o tubo em um Nutator à temperatura ambiente para remover os micróbios externos. Após 20 minutos de incubação no Nutator, gire os vermes a 1.000 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente, depois remova e descarte o supernatante M9 como demonstrado e repita o procedimento de lavagem três vezes com a mídia M9 contendo 0,05% de Triton X-100. Em seguida, incubar o tubo contendo nematoides durante a noite em um Nutator à temperatura ambiente adicionando o antibiótico recém-preparado e a solução de SDS.
Após o tratamento com antibiótico, gire os vermes no tubo a 1.000 vezes G por um minuto à temperatura ambiente. Remova o supernatante antes de adicionar 10 mililitros de M9 contendo 0,05% Triton X-100 e aperte adequadamente a tampa para incubar o tubo em um Nutator por 20 minutos à temperatura ambiente. Uma vez feito, gire os vermes a 1.000 vezes G por um minuto e repita este procedimento três vezes.
Após a quarta lavagem com o M9 contendo 0,05% Triton X-100, deixe a pelota de minhoca intacta em 100 microliters da solução e descarte o resto. Transfira 100 microliters do supernante e a pelota para o centro de uma placa NGM de 10 centímetros semeada com OP51 Escherichia coli. Deixe a placa secar sem ser perturbada enquanto os Dauers rastejam para fora do centro e através do gramado OP51 por 5 a 10 minutos.
Pegue cuidadosamente um Dauer e coloque-o em uma placa NGM de seis centímetros semeada com OP51. Da mesma forma, placa pelo menos 10 Dauers em placas NGM individuais de seis centímetros semeadas com OP51. Incubar as placas por quatro a cinco dias a 20 graus Celsius até que Dauers tenha crescido e a geração seguinte F1s tenha chegado ao estágio adulto, em seguida, verifique visualmente se há contaminação em todas as placas.
Para cada placa limpa, verifique a propagação do micróbio de interesse via Nomarski ou microscopia fluorescente dependendo do fenótipo de interesse. Para passar fome nos vermes e reduzir o número de bactérias OP51, incubar os nematoides a 20 graus Celsius por três a quatro dias. Adicione cinco mililitros da mídia M9 à placa de vermes recentemente famintos e, em seguida, transfira a mídia M9 e vermes para um tubo de centrífugo estéril de 15 milímetros para girar a 1.000 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente.
Remova o supernatante antes de lavar os vermes cinco vezes com 10 mililitros do M9 contendo 0,05% Triton X-100 em um Nutator por 20 minutos. Após a última lavagem, remova o supernascer sem perturbar a pelota em 100 microliters da solução e transfira o M9 e os worms para uma placa NGM de seis centímetros não semeada. Deixe a placa secar enquanto os vermes rastejam por 20 minutos para ajudar a remover op51 da cutícula e do intestino.
Quando a placa estiver seca, repita o procedimento adicionando 250 microliters do M9 e transferindo os vermes para uma nova placa NGM de seis centímetros não semeada para permitir que os vermes escorram enquanto a placa seca. Após 20 minutos, adicione 250 microliters do M9 à placa e transfira 100 microliters do M9 junto com vermes para um vidro de relógio limpo, em seguida, decapite os nematoides usando uma agulha de seringa calibre 26 enquanto segura o verme para baixo com outra agulha de seringa calibre 26. Uma vez decapitado, o intestino, uma massa granular e a gônada transparente naturalmente evitarão do corpo de nematoide, então cortarão um pedaço do intestino exposto e transferirão um único intestino dissecado em um tubo PCR de 0,5 mililitro contendo 10 microlitradores de água estéril.
Repita o procedimento para coletar intestinos de pelo menos cinco animais diferentes em tubos PCR. Congele os tubos PCR a menos 80 graus Celsius por um mínimo de cinco minutos. Descongele as amostras do intestino antes de prosseguir com pcr e sequenciamento para identificação.
Uma cepa de caenorhabditis tropicalis selvagem JU1848 foi encontrada com micróbios finos que colonizaram o lúmen do intestino de forma direcional. A cepa selvagem JU1848 propagou crescimento microbiano notável em placas padrão de NGM de seis centímetros semeadas com bactérias Escherichia coli OP51. Após a limpeza, uma placa de descendente de F1 de um único Dauer não mostrou contaminação microbiana visível após quatro dias de incubação.
Na imagem de Nomarski de um animal JU1848 decapitado, as bactérias colonizadoras eram visíveis no lúmen de um pedaço do intestino que está fora do corpo de nematoide. Algumas espécies de Caenorhabditis podem exigir uma menor concentração de SDS para evitar a morte de Dauer. Para propagar uma cepa de nematoide limpa, escolha Dauers que rastejou mais longe do centro como rastreamento ajuda a remover contaminantes sobreviventes.
