Метод был разработан для облегчения обогащения и идентификации нового микроба, представляющего интерес, обнаруженного у диких нематод Caenorhabditis, что позволяет продолжить исследование взаимодействий микробов-хозяев. Основным преимуществом методики является то, что она позволяет исследователям обогащать некультивируемые патогены и бактерии микробиома непосредственно в кишечнике диких нематод. Начните с получения дикого штамма caenorhabditis нематод с некультурным микробом, представляющим интерес, и выращивания червей на стандартной среде роста нематод или пластинах NGM, содержащих OP51 Escherichia coli в качестве источника пищи.
Инкубируйте нематод в течение четырех-пяти дней при температуре 20 градусов по Цельсию, пока не будет потреблена вся кишечная палочка OP51, и большинство червей не достигнут стадии Дауэра. Чтобы промыть нематод на стадии Дауэра, добавьте пять миллилитров среды минимальных солей M9 к шестисантиметровой пластине голодающих червей и используйте стерильную стеклянную пипетку и колбу, чтобы вытащить среду M9 и червей с пластины и перенести их в стерильную 15-миллилитровую центрифужную трубку. Раскрутите червей в 1000 раз G в течение 30 секунд при комнатной температуре, затем удалите и выбросьте супернатант M9 над гранулами червей, используя стерильную 15-миллилитровую пипетку, не беспокоя живых червей, оставив примерно 50 микролитров M9 над червями.
К той же трубке центрифуги добавьте 10 миллилитров среды M9, содержащей 0,05% Triton X-100, и достаточно затяните колпачок трубки, прежде чем поместить трубку на Nutator при комнатной температуре для удаления внешних микробов. После 20 минут инкубации на Nutator раскрутите червей в 1000 раз G в течение 30 секунд при комнатной температуре, затем удалите и выбросьте супернатант M9, как показано на рисунке, и повторите процедуру промывки три раза со средой M9, содержащей 0,05% Triton X-100. Затем инкубируйте трубку, содержащую нематод, на ночь на Nutator при комнатной температуре, добавив свежеприготовленный антибиотик и раствор SDS.
После лечения антибиотиком вращайте глистов в пробирке в 1000 раз г в течение одной минуты при комнатной температуре. Удалите супернатант перед добавлением 10 миллилитров M9, содержащих 0,05% Triton X-100, и достаточно затяните колпачок, чтобы инкубировать трубку на Nutator в течение 20 минут при комнатной температуре. После этого раскрутите червей в 1000 раз G в течение одной минуты и повторите эту процедуру три раза.
После четвертой промывки с M9, содержащим 0,05% Triton X-100, оставьте червячную гранулу нетронутой в 100 микролитрах раствора и выбросьте остальные. Перенесите 100 микролитров супернатанта и гранулы в центр 10-сантиметровой пластины NGM, засеянной кишечной палочкой OP51. Дайте тарелке высохнуть без помех, пока Dauers выползают из центра и через газон OP51 в течение 5-10 минут.
Осторожно возьмите один Dauer и нанесите его на шестисантиметровую пластину NGM, засеянную OP51. Таким же образом пластина не менее 10 Dauers в отдельных шестисантиметровых пластинах NGM засеяна OP51. Инкубируйте пластины в течение четырех-пяти дней при температуре 20 градусов по Цельсию, пока Dauers не вырастут и следующее поколение F1 не достигнет взрослой стадии, а затем визуально проверьте наличие загрязнения на всех пластинах.
Для каждой чистой пластины проверьте распространение интересующего микроба с помощью Номарски или флуоресцентной микроскопии в зависимости от интересующего фенотипа. Чтобы голодать червей и уменьшить количество бактерий OP51, инкубируйте нематод при 20 градусах Цельсия в течение трех-четырех дней. Добавьте пять миллилитров среды M9 к пластине недавно истощенных червей, а затем перенесите среду M9 и червей в стерильную 15-миллиметровую центрифужную трубку, чтобы вращаться вниз со скоростью 1000 G в течение 30 секунд при комнатной температуре.
Удалите супернатант перед промывкой червей пять раз с 10 миллилитрами M9, содержащими 0,05% Triton X-100 на Nutator в течение 20 минут. После последней промывки удалите супернатант, не нарушая гранулу, в 100 микролитрах раствора и перенесите M9 и червей на несеянную шестисантиметровую пластину NGM. Дайте пластине высохнуть, пока черви ползают в течение 20 минут, чтобы помочь удалить OP51 из кутикулы и кишечника.
Когда пластина высохнет, повторите процедуру, добавив 250 микролитров M9 и переместив червей на новую несеянную шестисантиметровую пластину NGM, чтобы черви могли ползать, пока пластина высыхает. Через 20 минут добавьте 250 микролитров M9 на пластину и переложите 100 микролитров M9 вместе с червями в чистое часовое стекло, затем обезглавите нематод с помощью иглы шприца 26 калибра, удерживая червя другой иглой шприца 26 калибра. После обезглавливания кишечник, гранулированная масса и прозрачная гонада естественным образом отклоняются от тела нематоды, затем отрезают кусок открытой кишки и переносят одну рассеченную кишку в 0,5-миллилитровую ПЦР-трубку, содержащую 10 микролитров стерильной воды.
Повторите процедуру, чтобы собрать кишечник по крайней мере у пяти разных животных в ПЦР-трубках. Заморозьте трубки ПЦР при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение как минимум пяти минут. Разморозьте образцы кишечника, прежде чем приступать к ПЦР и секвенированию для идентификации.
Было обнаружено, что дикий штамм Caenorhabditis tropicalis JU1848 имеет тонкие микробы, которые колонизируют просвет кишечника направленным образом. Дикий штамм JU1848 размножал заметный рост микробов на стандартных шестисантиметровых пластинах NGM, засеянных бактериями Escherichia coli OP51. После очистки пластина потомства F1 от одного Dauer не показала видимого микробного загрязнения после четырех дней инкубации.
На изображении Номарского обезглавленного животного JU1848 колонизирующие бактерии были видны в просвете куска кишечника, который находится за пределами тела нематоды. Некоторым видам Caenorhabditis может потребоваться более низкая концентрация SDS для предотвращения смерти Дауэра. Чтобы размножить чистый штамм нематоды, выбирайте Dauers, которые ползали дальше всего от центра, поскольку ползание помогает удалить выжившие загрязняющие вещества.
