El método fue desarrollado para facilitar el enriquecimiento y la identificación de un nuevo microbio de interés que se encuentra en los nematodos salvajes de Caenorhabditis, lo que permite una mayor investigación sobre las interacciones de los microbios huéspedes. La principal ventaja de la técnica es que permite a los investigadores enriquecer para patógenos no cultivables y bacterias del microbioma directamente en el intestino de los nematodos silvestres. Comience por obtener la cepa silvestre caenorhabditis de nematodos con un microbio inculcultable de interés y cultivar los gusanos en un medio de crecimiento de nematodos estándar o placas NGM que contengan OP51 Escherichia coli como fuente de alimento.
Incubar los nematodos durante cuatro o cinco días a 20 grados centígrados hasta que se consuma toda la OP51 Escherichia coli y la mayoría de los gusanos hayan alcanzado la etapa de Dauer. Para lavar los nematodos en la etapa de Dauer, agregue cinco mililitros de medios de sales mínimas M9 a una placa de seis centímetros de gusanos hambrientos y use una pipeta de vidrio estéril y una bombilla para pipetear los medios M9 y los gusanos de la placa y transferirlos a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Gire hacia abajo los gusanos a 1, 000 veces G durante 30 segundos a temperatura ambiente, luego retire y deseche el sobrenadante M9 por encima del gránulo de gusanos usando una pipeta estéril de 15 mililitros sin molestar a los gusanos vivos dejando aproximadamente 50 microlitros de M9 por encima de los gusanos.
Al mismo tubo de centrífuga, agregue 10 mililitros del medio M9 que contiene 0.05% de Triton X-100 y apriete adecuadamente la tapa del tubo antes de colocar el tubo en un Nutator a temperatura ambiente para eliminar los microbios externos. Después de 20 minutos de incubación en el Nutator, gire hacia abajo los gusanos a 1, 000 veces G durante 30 segundos a temperatura ambiente, luego retire y deseche el sobrenadante M9 como se ha demostrado y repita el procedimiento de lavado tres veces con el medio M9 que contiene 0.05% de Triton X-100. A continuación, incube el tubo que contiene nematodos durante la noche en un Nutator a temperatura ambiente agregando el antibiótico recién preparado y la solución SDS.
Después del tratamiento con antibiótico, gire hacia abajo los gusanos en el tubo a 1, 000 veces G durante un minuto a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante antes de agregar 10 mililitros de M9 que contengan 0.05% Triton X-100 y apriete adecuadamente la tapa para incubar el tubo en un Nutator durante 20 minutos a temperatura ambiente. Una vez hecho esto, gire hacia abajo los gusanos a 1, 000 veces G durante un minuto y repita este procedimiento tres veces.
Después del cuarto lavado con el M9 que contiene 0.05% Triton X-100, deje el pellet de gusano sin molestar en 100 microlitros de la solución y deseche el resto. Transfiera 100 microlitros del sobrenadante y el pellet al centro de una placa NGM de 10 centímetros sembrada con OP51 Escherichia coli. Deje que la placa se seque sin ser molestada mientras los Dauers se arrastran fuera del centro y a través del césped OP51 durante 5 a 10 minutos.
Recoja cuidadosamente un solo Dauer y colóquelo en una placa NGM de seis centímetros sembrada con OP51. De la misma manera, platear al menos 10 Dauers en placas NGM individuales de seis centímetros sembradas con OP51. Incubar las placas durante cuatro o cinco días a 20 grados centígrados hasta que los Dauers hayan crecido y la siguiente generación de F1 haya alcanzado la etapa adulta, luego verifique visualmente si hay contaminación en todas las placas.
Para cada placa limpia, verifique la propagación del microbio de interés a través de Nomarski o microscopía fluorescente dependiendo del fenotipo de interés. Para matar de hambre a los gusanos y reducir el número de bacterias OP51, incuba los nematodos a 20 grados centígrados durante tres o cuatro días. Agregue cinco mililitros del medio M9 a la placa de gusanos recientemente hambrientos y luego transfiera los medios y gusanos M9 a un tubo de centrífuga estéril de 15 milímetros para girar a 1,000 veces G durante 30 segundos a temperatura ambiente.
Retire el sobrenadante antes de lavar los gusanos cinco veces con 10 mililitros del M9 que contiene 0.05% Triton X-100 en un Nutator durante 20 minutos. Después del último lavado, retire el sobrenadante sin molestar el pellet en 100 microlitros de la solución y transfiera el M9 y los gusanos a una placa NGM de seis centímetros sin sembrar. Deje que la placa se seque mientras los gusanos se arrastran durante 20 minutos para ayudar a eliminar OP51 de la cutícula y el intestino.
Cuando la placa esté seca, repita el procedimiento agregando 250 microlitros del M9 y transfiriendo los gusanos a una nueva placa NGM de seis centímetros sin sembrar para permitir que los gusanos se arrastren mientras la placa se seca. Después de 20 minutos, agregue 250 microlitros del M9 a la placa y transfiera 100 microlitros del M9 junto con gusanos a un vidrio de reloj limpio, luego decapite los nematodos usando una aguja de jeringa de calibre 26 mientras sostiene el gusano con otra aguja de jeringa de calibre 26. Una vez decapitado, el intestino, una masa granular y la gónada transparente se apartarán naturalmente del cuerpo del nematodo, luego cortarán un pedazo del intestino expuesto y transferirán un solo intestino diseccionado a un tubo de PCR de 0,5 mililitros que contiene 10 microlitros de agua estéril.
Repita el procedimiento para recolectar intestinos de al menos cinco animales diferentes en tubos de PCR. Congele los tubos de PCR a menos 80 grados centígrados durante un mínimo de cinco minutos. Descongelar las muestras intestinales antes de proceder con la PCR y la secuenciación para su identificación.
Se encontró que una cepa silvestre de Caenorhabditis tropicalis JU1848 tenía microbios delgados que colonizaban la luz del intestino de manera direccional. La cepa silvestre JU1848 propagó un notable crecimiento microbiano en placas NGM estándar de seis centímetros sembradas con la bacteria Escherichia coli OP51. Después de la limpieza, una placa de progenie F1 de un solo Dauer no mostró contaminación microbiana visible después de cuatro días de incubación.
En la imagen de Nomarski de un animal JU1848 decapitado, las bacterias colonizadoras eran visibles en la luz de un pedazo del intestino que está fuera del cuerpo del nematodo. Algunas especies de Caenorhabditis pueden requerir una concentración más baja de SDS para prevenir la muerte de Dauer. Para propagar una cepa de nematodo limpia, elija Dauers que se arrastraron más lejos del centro, ya que el rastreo ayuda a eliminar los contaminantes sobrevivientes.
