La méthode a été développée pour faciliter l’enrichissement et l’identification d’un nouveau microbe d’intérêt trouvé dans les nématodes sauvages de Caenorhabditis, permettant une étude plus approfondie des interactions entre les microbes hôtes. Le principal avantage de la technique est qu’elle permet aux chercheurs de s’enrichir pour les agents pathogènes non cultivables et les bactéries du microbiome directement dans l’intestin des nématodes sauvages. Commencez par obtenir la souche sauvage de nématodes Caenorhabditis avec un microbe inculturable d’intérêt et cultivez les vers sur un milieu de croissance de nématode standard ou des plaques NGM contenant OP51 Escherichia coli comme source de nourriture.
Incuber les nématodes pendant quatre à cinq jours à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que tout l’OP51 Escherichia coli soit consommé et que la majorité des vers aient atteint le stade de Dauer. Pour laver les nématodes au stade Dauer, ajoutez cinq millilitres de sels minimaux M9 à une plaque de six centimètres de vers affamés et utilisez une pipette et une ampoule en verre stérile pour pipeter les milieux M9 et les vers de la plaque et les transférer dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 millilitres. Faites tourner les vers à 1 000 fois G pendant 30 secondes à température ambiante, puis retirez et jetez le surnageant M9 au-dessus de la pastille de vers à l’aide d’une pipette stérile de 15 millilitres sans perturber les vers vivants en laissant environ 50 microlitres de M9 au-dessus des vers.
Dans le même tube de centrifugeuse, ajouter 10 millilitres du milieu M9 contenant 0,05 % de Triton X-100 et serrer adéquatement le capuchon du tube avant de placer le tube sur un nutator à température ambiante pour éliminer les microbes externes. Après 20 minutes d’incubation sur le Nutator, faire tourner les vers à 1 000 fois G pendant 30 secondes à température ambiante, puis retirer et jeter le surnageant M9 comme démontré et répéter la procédure de lavage trois fois avec le milieu M9 contenant 0,05% de Triton X-100. Ensuite, incuber le tube contenant des nématodes pendant la nuit sur un Nutator à température ambiante en ajoutant l’antibiotique fraîchement préparé et la solution de FDS.
Après le traitement antibiotique, faites tourner les vers dans le tube à 1 000 fois G pendant une minute à température ambiante. Retirez le surnageant avant d’ajouter 10 millilitres de M9 contenant 0,05% de Triton X-100 et serrez correctement le capuchon pour incuber le tube sur un Nutator pendant 20 minutes à température ambiante. Une fois cela fait, faites tourner les vers à 1 000 fois G pendant une minute et répétez cette procédure trois fois.
Après le quatrième lavage avec le M9 contenant 0,05% de Triton X-100, laissez la pastille de ver intacte dans 100 microlitres de la solution et jetez le reste. Transférer 100 microlitres du surnageant et de la pastille au centre d’une plaque NGM de 10 centimètres ensemencée avec OP51 Escherichia coli. Laissez la plaque sécher sans être dérangé pendant que les Dauers rampent hors du centre et à travers la pelouse OP51 pendant 5 à 10 minutes.
Prenez soigneusement un seul Dauer et plaquez-le sur une plaque NGM de six centimètres ensemencée d’OP51. De la même manière, plaquez au moins 10 Dauers dans des plaques NGM individuelles de six centimètres ensemencées d’OP51. Incuber les plaques pendant quatre à cinq jours à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que les Dauers aient grandi et que les F1 de génération suivante aient atteint le stade adulte, puis vérifiez visuellement la contamination sur toutes les plaques.
Pour chaque plaque propre, vérifiez la propagation du microbe d’intérêt via Nomarski ou la microscopie fluorescente en fonction du phénotype d’intérêt. Pour affamer les vers et réduire le nombre de bactéries OP51, incuber les nématodes à 20 degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Ajouter cinq millilitres de milieu M9 à la plaque de vers récemment affamés, puis transférer le milieu M9 et les vers dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 millimètres pour tourner vers le bas à 1 000 fois G pendant 30 secondes à température ambiante.
Retirez le surnageant avant de laver les vers cinq fois avec 10 millilitres du M9 contenant 0,05% de Triton X-100 sur un Nutator pendant 20 minutes. Après le dernier lavage, retirez le surnageant sans perturber la pastille dans 100 microlitres de la solution et transférez le M9 et les vers sur une plaque NGM non ensemencée de six centimètres. Laissez sécher la plaque pendant que les vers rampent pendant 20 minutes pour aider à éliminer OP51 de la cuticule et de l’intestin.
Lorsque la plaque est sèche, répétez la procédure en ajoutant 250 microlitres du M9 et en transférant les vers sur une nouvelle plaque NGM non ensemencée de six centimètres pour permettre aux vers de ramper pendant que la plaque sèche. Après 20 minutes, ajoutez 250 microlitres du M9 à la plaque et transférez 100 microlitres du M9 avec des vers sur un verre de montre propre, puis décapitez les nématodes à l’aide d’une aiguille de seringue de calibre 26 tout en maintenant le ver vers le bas avec une autre aiguille de seringue de calibre 26. Une fois décapité, l’intestin, une masse granulaire et la gonade transparente s’éloignent naturellement du corps du nématode, puis coupent un morceau de l’intestin exposé et transfèrent un seul intestin disséqué dans un tube PCR de 0,5 millilitre contenant 10 microlitres d’eau stérile.
Répétez la procédure pour recueillir les intestins d’au moins cinq animaux différents dans des tubes PCR. Congelez les tubes PCR à moins 80 degrés Celsius pendant au moins cinq minutes. Décongeler les échantillons intestinaux avant de procéder à la PCR et au séquençage pour identification.
Une souche sauvage de Caenorhabditis tropicalis JU1848 s’est avérée avoir de minces microbes qui colonisaient la lumière de l’intestin de manière directionnelle. La souche sauvage JU1848 a propagé une croissance microbienne notable sur des plaques NGM standard de six centimètres ensemencées de bactéries Escherichia coli OP51. Après nettoyage, une plaque de descendance F1 d’un seul Dauer n’a montré aucune contamination microbienne visible après quatre jours d’incubation.
Dans l’image de Nomarski d’un animal JU1848 décapité, les bactéries colonisatrices étaient visibles dans la lumière d’un morceau de l’intestin qui se trouve à l’extérieur du corps du nématode. Certaines espèces de Caenorhabditis peuvent nécessiter une concentration de FDS plus faible pour prévenir la mort de Dauer. Pour propager une souche de nématode propre, choisissez des Dauers qui ont rampé le plus loin du centre, car ramper aide à éliminer les contaminants survivants.
