Протокол помогает студентам четко идентифицировать отдельные инфекции и легко выполнять анализ, что делает его более эффективным для количественной оценки вирусного титра. Этот протокол включает в себя простую процедуру фиксации и окрашивания, которая дает надежные и воспроизводимые результаты. Этот метод может дать представление о точности и эффективности противовирусного лечения заболеваний.
Более сложными препятствиями этого протокола являются подсчет клеток для посевных пластин, следя за тем, чтобы клетки не переполнялись, не высыхали и не царапались на протяжении всего процесса. Можно также найти трудности в общем дотошном характере этого протокола. Тем не менее, практика является основным фактором успеха этого эксперимента.
Для начала завершите разбавление образца добавлением вируса к клеткам за один лабораторный сеанс. Последовательно разбавляйте каждый образец вируса, нагроможденный в PBS. Обычно используют 10-кратные разведения для наиболее точного отслеживания.
Храните все вирусные разведения на льду до тех пор, пока не будете готовы добавить эти разбавленные образцы вируса в клетки. Извлеките культуральную среду из одной или двух лунок с помощью пипетки. Осторожно добавляйте разбавленный образец вируса по каплям к каждому монослою клеток по каплям через боковую часть каждой лунки.
Повторяйте процесс для каждой одной или двух скважин, пока вся пластина не будет заполнена образцами вируса, которые будут ошлетены. Аккуратно покачивайте всю тарелку вручную. Затем инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия в течение одного часа, чтобы обеспечить адсорбцию вируса.
Через каждые 10 минут извлекайте пластину из инкубатора, осторожно снова раскачивайте ее, чтобы вирус распространялся более равномерно по каждой лунке, а затем поместите ее обратно в инкубатор. Чтобы уменьшить возможность непреднамеренного подсчета неабсорбированного инокулята, удалите образец вируса из скважин с помощью наконечника пипетки объемом 1000 микролитров и выбросьте образец в стакан для отходов. Поместите 2,5 миллилитра накладки метилцеллюлозы на пластину и поместите ее обратно в инкубатор.
Дезинфицируйте отработанный стакан, как правило, с добавлением отбеливателя, йодофора или аналогичного вируцида, прежде чем удалить его из шкафа биобезопасности. После двухдневной инкубации удалите накладку метилцеллюлозы из одной или двух лунок за раз с помощью пипетки и поместите ее в стакан для отходов. Добавьте примерно два миллилитра 1% кристаллической фиалки в 50% этанола в каждую лунку.
Инкубируйте пластину со всеми лунками, заполненными пятном, в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. На этом этапе продезинфицируйте стакан отходов, как было продемонстрировано ранее. Энергично вымойте тарелки водопроводной водой до тех пор, пока сток не станет прозрачным.
Убедитесь, что в каждой серии разбавления существуют примерно 10-кратные различия в количестве бляшек. На рисунке изображено 10-кратное уменьшение количества бляшек, когда счетное количество бляшек упало в диапазоне от 10 до минус четырех для всех трех реплик. Первые три изображения на рисунке изображают таблички в разведении от 10 до минус трех.
Тем не менее, нижний ряд показывает результаты, когда анализ налета не проводится хорошо. Очень мало бляшек, видимых от любого разведения в видимых областях вокруг вершины, где клетки Vero полностью поднялись из субстрата. Аналогичным образом, этот рисунок показывает проблемы с высыханием клеток или неправильным обращением во время анализа бляшек.
Однако этот показатель критически показывает плохой посев клеток Vero. В каждом колодце видны более темные фиолетовые пятна, свидетельствующие о клетках, плохо распределенных по колодцу и сложенных друг на друга кластерами. Для достижения наилучших результатов убедитесь, что вирус равномерно распространяется по пластине, чтобы избежать скопления бляшек Анализ бляшек более эффективен, чем другие количественные методы, потому что он учитывает только живой вирус.
Таким образом, истинная противовирусная эффективность может быть установлена. Кроме того, этот метод позволил нам количественно оценить присутствие вируса на фомитах и изучить эффективность доставки лекарств из новых медицинских устройств в нашем секторе исследований вируса герпеса.
