כאן, פרוטוקול מוצג עבור הקרנה יעילה ומדויקת של גנוטיפים טבק עבור Phytophthora nicotianae התנגדות שתילים. זה מעשי עבור רבייה מדויקת, כמו גם מחקר מנגנון מולקולרי. חומרים. להשיג זני טבק Beinhart1000-1, מבחר של Beinhart1000 BH, ו Xiaohuangjin1025 XHJ מן Geneback הלאומי לטווח בינוני של משאב Germplasm טבק של סין.
BH עמיד, ואילו XHJ רגיש לזיהום פיטופתורה ניקוטיאנה. שתילת גנוטיפים טבק להערכת התנגדות פיטופתורה nicotianae. מערבבים זרעי טבק עם vermiculite ומשדרים את הזרעים בעדינות על אדמת העציץ המעוקרת.
מניחים את הסירים בתא הצמיחה. שמור על טמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס תחת תקופת צילום כהה של 16 שעות / שמונה שעות. הכן התקנים הידרופוניים עם מגשים ויריעות קצף.
לאחר הזרעים נובטים, דוקרים שתילים מתוך אדמת העציץ. לשטוף את השורשים בעדינות עם מים deionized סטריליים להשתיל אותם לתוך המכשירים הידרופוניים. מקם את המכשירים בתאי אקלים ב-25 מעלות צלזיוס תחת תקופת צילום כהה של שש שעות/שמונה שעות למשך 24 שעות.
הכינו מראש את התמיסה התזונתית של הוגלנד. להשתיל את השתילים למכשירים הידרופוניים עם פתרון מזין Hoagland. מקם את המכשירים בתא האקלים ב 25 מעלות צלזיוס תחת 16 שעות אור / שמונה שעות תקופת תמונה כהה במשך שבועיים.
הכנת השעיית פיטופטורה ניקוטיאנה זוספור. הכנת מדיום אגר שיבולת שועל. שוקלים 33 גרם של שיבולת שועל לתוך כלי חלול ולהוסיף 1, 000 מיליליטר של מים סטריליים.
מרתיחים על תנור אלקטרומגנטי. לאחר שיבולת שועל הופך דביק, מסננים את הנוזל דרך חתיכת גזה סטרילית. יוצקים את הנוזל לתוך צילינדר מדורג 1,000 מיליליטר ולהתאים את הנפח ל 1, 000 מיליליטר עם מים סטריליים.
יוצקים את הנוזל לתוך בקבוק ריאגנט זכוכית ולהוסיף 18 גרם של אגר. לנער היטב autoclave את תערובת שיבולת שועל אגר בינוני ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. להשאיר אותו בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
יוצקים כ -20 מיליליטר של אגר שיבולת שועל מעוקרת מדיום לכל צלחת פטרי. השאירו את מנות הפטרי בטמפרטורת החדר להתקרר ביסודיות לפני טיפוח התפטיר. טיפוח תפטיר.
הכן אגרופים בקוטר סנטימטר אחד וקיסמי שיניים מראש על ידי autoclaving אותם autoclave ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ניקוב חורים בתרביות אגר תפטיאריות פיטופתורה ניקוטיאנה כדי להכין מחצלות תפטיר עגולות. בחרו מחצלות תפטיר, הניחו את הצד התפטיר על מדיום אגר שיבולת שועל ודגרו את התפטיר ב 25 מעלות צלזיוס בחושך במשך 14 ימים.
הכנת השעיית פיטופטורה ניקוטיאנה זוספור. הוסף 0.1% אשלגן חנקתי פתרון לכל גידול תפטיר 15 מיליליטר למנה, ואחריו culturing בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לגרום ספורנגיום. שמור את הכלים ב 25 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות כדי לשחרר zoospores.
לאסוף את ההשעיה zoospore לכוס ולמדוד את ריכוז zoospore על ידי מיקרוסקופ hemocytometer. התאם את ריכוז zoospore ל 1 פעמים 10 כדי zoospore הרביעי למיליליטר עם מים סטריליים. זיהוי זני טבק עמידים למחלות.
קח שתילים מן הפתרון התזונתי Hoagland ולחסן אותם על ידי טבילת השורשים ב 20 מיליליטר של פיטופתורה nicotianae zoospore השעיה בצלחת פטרי 90 מילימטרים ב 25 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות בחושך. לאחר החיסון, לשים שתילי טבק למנות פטרי חדשות עם 10 מיליליטר של מים סטריליים, טבילה השורשים. שמור את השורשים לחים על ידי כיסוי עם שתי חתיכות של נייר סינון.
שמור את הכלים ב 25 מעלות צלזיוס 16 שעות אור / שמונה שעות תקופת צילום כהה. לאחר יומיים עד שלושה ימים, שים לב לחומרת המחלה. לטיפול בקרה, לשים את שתילי הטבק ישירות בצלחות פטרי עם מים סטריליים 10 מיליליטר, טבילת השורשים לכסות את השורשים על ידי שתי חתיכות של נייר מסנן.
הערכה של זיהום פיטופתורה ניקוטיאנה. להעריך את חומרת המחלה ארבעה עד חמישה ימים לאחר החיסון. בהתבסס על התקן הלאומי הסיני, ציון חומרת מחלת צמחים בודדים בסולם מאפס עד תשע.
כיתה 0 אומרת שאין תסמינים על כל הצמח. כיתה 1 פירושה נגעים גזע פחות מ 1/3 של היקף גזע או 1/3 של עלים לנבול. כיתה 3 פירושה נגעים בגבעול בין 1/3 ל 1/2 של היקף גזע או בין 1/3 ו 1/2 של עלים מעט נבול.
דרגה 5 פירושה נגעים בגזע הגדולים מ-1/2 מהיקף הגבעול, אך לא לגמרי סביב ההיקף או בין 1/2 ל-2/3 של עלים שנבולים. דרגה 7 פירושה נגעי גזע סביב היקף גזע שלם או יותר מ 2/3 של עלים לנבול. כיתה 9 אומרת שצמחים נראים מתים.
חשב את מדד המחלה באמצעות הנוסחה הבאה. חומרת המחלה חולקה לשש כיתות. תוצאות מייצגות.
צמחים בני ארבעה שבועות של BH מגוון עמיד ומגוון רגיש XHJ אותגרו עם פיטופתורה nicotianae באמצעות השיטה המוצגת במאמר זה. בשלושה ימים לאחר החיסון, ב- XHJ, נגעי גזע שכיסו כ -1/2 מהיקף הגזע ו -1/2 מהעלים היו מעט נבולים. במגוון העמיד BH, לא נצפו תסמינים.
בארבעה ימים לאחר החיסון, ניבול עלים ונגעים חמורים בגזע התרחשו ב- XHJ ואילו תסמינים אלה לא הופיעו BH.At חמישה ימים לאחר החיסון, חומרת מחלת הצמחים הבודדת נרשמה וחושבה על סמך התקן הלאומי הסיני לשיטת הציון והחקירה של מחלות טבק ומזיקי חרקים. מדד המחלה הממוצע של BH היה 6.48, מה שמראה התנגדות R על פי התקן, ומדד המחלה הממוצע של XHJ היה 76.85, מה שמראה רגישות S על פי התקן. כדי לאשר את יעילות החיסון, ביומסה פתוגן יחסית כונתה על ידי PCR בזמן אמת.
התוצאה של PCR בזמן אמת מאשרת את התצפיות הפנוטיפיות. חמישה צאצאים מאוכלוסיית BC4 F2 של הכלאה בין BH ל- XHJ, שני זני התנגדות ביניים, K326 ו- Yunyan87, הוערכו על ידי שיטת חיסון השעיית zoospore ושיטת חיסון גרגירי שיבולת שועל. שיטת ההשעיה Zoospore בוצעה על שתילים קטנים ושיטת חיסון גרגרי שיבולת שועל בוצעה על צמחים בוגרים.
עבור חמשת הצאצאים מאוכלוסיית BC4 F2, מדד המחלה נע בין 16.49 ל 77.60 בשיטת השעיית zoospore ונע בין 10.33 ל 83.08 בשיטת גרגרי שיבולת שועל. סיווגי ההתנגדות בין שתי שיטות זיהום עולים בקנה אחד עם השני. עם שני זני התנגדות ביניים K326 ו Yunyan87, ההערכה הראתה עמיד בשתי השיטות.
נתונים אלה ממחישים את הקשר בין שתי שיטות חיסון למרות שהם בוצעו על טבק בתקופת צמיחה שונה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה יעילה ואמינה כדי להעריך את ההתנגדות של טבק לזיהום על ידי שלב שתיל P.nicotianae. פרוטוקול זה הוא מעשי עבור הרבייה, כמו גם עבור מחקר מנגנון מולקולרי כמו שיטת דגני שיבולת שועל ישים עבור הקרנת התנגדות בקנה מידה גדול של צמחים בוגרים.
שתי שיטות אלה יכולות להשתמש במשלים. תודה על הצפייה.
