Aqui, é apresentado um protocolo para a triagem eficiente e precisa dos genótipos do tabaco para resistência à Phytophthora nicotianae em mudas. É prático para a reprodução de precisão, bem como para pesquisa de mecanismos moleculares. Materiais. Obter as variedades de tabaco Beinhart1000-1, uma seleção de Beinhart1000 BH, e Xiaohuangjin1025 XHJ do National Medium-term Geneback do Recurso de Germoplasma do Tabaco da China.
BH é resistente, enquanto XHJ é suscetível à infecção por Phytophthora nicotianae. Plantio de genótipos de tabaco para avaliação da resistência de Phytophthora nicotianae. Misture as sementes de tabaco com vermiculite e transmita as sementes suavemente no solo esterilizado.
Coloque os potes na câmara de crescimento. Mantenha uma temperatura constante de 25 graus Celsius sob um período de 16 horas de luz/oito horas de foto escura. Prepare dispositivos hidropônicos com bandejas e folhas de espuma.
Depois que as sementes germinam, as mudas espinhosas saem do solo de vasos. Lave as raízes suavemente com água deionizada estéril e transplante-as nos dispositivos hidropônicos. Coloque os dispositivos em câmaras climáticas a 25 graus Celsius sob um período de seis horas de luz/oito horas de foto escura durante 24 horas.
Prepare a solução de nutrientes Hoagland com antecedência. Transplante das mudas para dispositivos hidropônicos com solução de nutrientes Hoagland. Coloque os dispositivos na câmara climática a 25 graus Celsius sob período de 16 horas de luz/oito horas de foto escura durante duas semanas.
Preparação da suspensão do zoológico Phytophthora nicotianae. Preparação do ágar médio de aveia. Pesar 33 gramas de aveia em um oco e adicionar 1.000 mililitros de água estéril.
Ferva em um forno eletromagnético. Depois que a aveia ficar pegajosa, coe o líquido através de um pedaço de gaze estéril. Despeje o líquido em um cilindro graduado de 1.000 mililitros e ajuste o volume para 1.000 mililitros com água estéril.
Despeje o líquido em uma garrafa de reagente de vidro e adicione 18 gramas de ágar. Agite bem e autoclave a mistura de aveia ágar médio a 121 graus Celsius por 15 minutos. Deixe em temperatura ambiente por 30 minutos.
Despeje cerca de 20 mililitros de ágar de aveia esterilizado médio para cada placa de Petri. Deixe as placas de Petri à temperatura ambiente para esfriar bem antes do cultivo micelial. Cultivo micelial.
Prepare socos de um centímetro de diâmetro e palitos de dente de antemão, autoclavando-os em uma autoclave a 121 graus Celsius por 15 minutos. Furos em Phytophthora nicotianae mycelial culturas de ágar para fazer tapetes de micélio redondos. Escolha tapetes de micrúbio, coloque o lado mycelial no meio de ágar de aveia e incuba o micélio a 25 graus Celsius no escuro por 14 dias.
Preparação da suspensão do zoológico Phytophthora nicotianae. Adicione 0,1% solução de nitrato de potássio a cada cultivo micelial 15 mililitros por prato, seguido de cultivo a quatro graus Celsius por 20 minutos para induzir o esporangium. Mantenha os pratos a 25 graus Celsius por 25 minutos para liberar zoospores.
Colete a suspensão do zoospore a um béquer e meça a concentração de zoospore por microscópio e hemócito. Ajuste a concentração do zoospore para uma vez 10 para o quarto zoospore por mililitro com água estéril. Identificação de variedades de tabaco resistentes a doenças.
Pegue as mudas da solução de nutrientes hoagland e inocula-as imergindo as raízes em 20 mililitros de suspensão zoospora Phytophthora nicotianae em uma placa de Petri de 90 milímetros a 25 graus Celsius por três horas no escuro. Após a inoculação, coloque as mudas de tabaco em novas placas de Petri com 10 mililitros de água estéril, imergindo as raízes. Mantenha as raízes úmidas cobrindo com dois pedaços de papel filtro.
Mantenha os pratos em 25 graus Celsius 16 horas de luz/período de oito horas de foto escura. Após dois a três dias, observe a gravidade da doença. Para o tratamento de controle, coloque as mudas de tabaco diretamente nas placas de Petri com 10 mililitros de água estéril, imergindo as raízes e cobrindo as raízes por dois pedaços de papel filtro.
Avaliação da infecção por Phytophthora nicotianae. Avalie a gravidade da doença de quatro a cinco dias após a inoculação. Com base no padrão nacional chinês, escore a gravidade da doença vegetal individual em uma escala de zero a nove.
Grau 0 significa que não há sintomas em toda a planta. Grau 1 significa lesões de haste inferiores a 1/3 da cintura-tronco ou 1/3 de folhas murchando. Grau 3 significa lesões de haste entre 1/3 e 1/2 de cintura-tronco ou entre 1/3 e 1/2 de folhas ligeiramente murchas.
Grau 5 significa lesões de haste maiores que 1/2 de cintura de haste, mas não completamente ao redor da cintura ou entre 1/2 e 2/3 de folhas murchando. Grau 7 significa lesões de haste em torno de toda a cintura da haste ou maior que 2/3 de folhas murchando. Grau 9 significa que as plantas parecem mortas.
Calcule o índice da doença usando a seguinte fórmula. A gravidade da doença foi dividida em seis graus. Resultados representativos.
Plantas de quatro semanas de idade da variedade resistente BH e variedade suscetível XHJ foram desafiadas com Phytophthora nicotianae usando o método apresentado neste artigo. Em três dias após a inoculação, em XHJ, as lesões do caule cobriram aproximadamente 1/2 da cintura da haste e 1/2 das folhas foram ligeiramente murchas. Na variedade resistente BH, não foram observados sintomas.
Aos quatro dias após a inoculação, o murcho da folha e as lesões graves do caule ocorreram no XHJ, enquanto esses sintomas não apareceram em BH.At cinco dias após a inoculação, a gravidade da doença vegetal individual foi registrada e calculada com base no padrão nacional chinês para o método de grau e investigação de doenças do tabaco e pragas de insetos. O índice médio da doença de BH foi de 6,48, o que mostra resistência R de acordo com a norma, e o índice médio de doença de XHJ foi de 76,85, o que mostra suscetibilidade S de acordo com a norma. Para confirmar a eficiência da inoculação, a biomassa relativa do patógeno foi quantificada por PCR em tempo real.
O resultado do PCR em tempo real confirma as observações fenotípicas. Cinco progênios da população BC4 F2 de um cruzamento entre BH e XHJ, duas variedades de resistência intermediária, K326 e Yunyan87, foram avaliados pelo método de inoculação de suspensão do zoospore e método de inoculação de grãos de aveia. O método de suspensão do zoospore foi realizado em pequenas mudas e foi realizado método de inoculação de grãos de aveia em plantas adultas.
Para os cinco progens da população BC4 F2, o índice da doença variou de 16,49 a 77,60 pelo método de suspensão do zoospore e variou de 10,33 a 83,08 pelo método de grãos de aveia. As classificações de resistência entre dois métodos de infecção são em sua maioria consistentes entre si. Com as duas variedades de resistência intermediária K326 e Yunyan87, a avaliação mostrou-se resistente em ambos os métodos.
Esses dados ilustram a correlação entre dois métodos de inoculação, apesar de terem sido realizados no tabaco em diferentes períodos de crescimento. O protocolo descrito aqui é um método eficiente e confiável para avaliar a resistência do tabaco à infecção pelo estágio de muda de P.nicotianae. Este protocolo é prático para a reprodução, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares, uma vez que o método de grãos de aveia é aplicável para o rastreamento de resistência em larga escala de plantas adultas.
Estes dois métodos podem usar complementar. Obrigado por assistir.
