Здесь представлен протокол эффективного и точного скрининга генотипов табака на устойчивость Phytophthora nicotianae у саженцев. Он практичен для точного разведения, а также исследования молекулярного механизма. Материалы. Получите сорта табака Beinhart1000-1, подборку Beinhart1000 BH и Xiaohuangjin1025 XHJ из Национального среднесрочного генеара ресурса зародышевой плазмы табака Китая.
BH устойчив, тогда как XHJ восприимчив к инфекции Phytophthora nicotianae. Посадка генотипов табака для оценки устойчивости Phytophthora nicotianae. Смешайте семена табака с вермикулитом и аккуратно распределите семена на стерилизованную почву для горшков.
Поместите горшки в камеру роста. Поддерживайте постоянную температуру 25 градусов по Цельсию при 16-часовом световом / восьмичасовом темном периоде фотосъемки. Подготовьте гидропонные устройства с лотками и пенопластовыми листами.
После того, как семена прорастут, выколите рассаду из горшечной почвы. Аккуратно промойте корни стерильной деионизированной водой и пересадите их в гидропонные устройства. Поместите устройства в климатические камеры при температуре 25 градусов по Цельсию под шестичасовым световым / восьмичасовым темным периодом фотосъемки в течение 24 часов.
Заранее приготовьте питательный раствор Hoagland. Пересадите рассаду на гидропонные устройства питательным раствором Hoagland. Поместите устройства в климатическую камеру при температуре 25 градусов по Цельсию при 16-часовом световом / восьмичасовом темном периоде фотосъемки в течение двух недель.
Приготовление суспензии зооспоры Phytophthora nicotianae. Приготовление овсяной агаровой среды. Взвесьте 33 грамма овсянки в полую посуду и добавьте 1000 миллилитров стерильной воды.
Варить на электромагнитной духовке. После того, как овсянка станет липкой, процедите жидкость через кусочек стерильной марли. Налейте жидкость в градуированный цилиндр объемом 1000 миллилитров и отрегулируйте объем до 1000 миллилитров стерильной водой.
Налейте жидкость в стеклянную бутылку с реагентом и добавьте 18 граммов агара. Хорошо встряхните и автоклавируйте смесь овсяным агаром при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут. Оставьте при комнатной температуре на 30 минут.
Налейте около 20 миллилитров стерилизованной овсяной агаровой среды на каждую чашку Петри. Оставьте чашку Петри при комнатной температуре тщательно остыть перед культивированием мицелиальности. Культивирование мицелия.
Заранее подготовьте перфораторы и зубочистки диаметром один сантиметр, автоклавировав их в автоклаве при 121 градусе Цельсия в течение 15 минут. Проделайте отверстия в культурах мицелиального агара Phytophthora nicotianae, чтобы сделать круглые мицелиальные маты. Выделите мицелиальные маты, положите мицелиальную сторону вниз на овсяную агаровую среду и высиживайте мицелий при температуре 25 градусов Цельсия в темноте в течение 14 дней.
Приготовление суспензии зооспоры Phytophthora nicotianae. Добавляйте 0,1% раствор нитрата калия к каждой культивации мицелиала по 15 миллилитров на блюдо с последующим культивированием при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут, чтобы вызвать спорангий. Держите посуду при температуре 25 градусов по Цельсию в течение 25 минут, чтобы освободить зооспоры.
Соберите суспензию зооспоры в стакан и измерьте концентрацию зооспоры с помощью микроскопа и гемоцитометра. Отрегулируйте концентрацию зооспоры в один раз от 10 до четвертой зооспоры на миллилитр стерильной водой. Выявление устойчивых к болезням сортов табака.
Возьмите рассаду из питательного раствора Hoagland и привите их, погружая корни в 20 миллилитров суспензии Phytophthora nicotianae zoospore в чашку Петри 90 миллиметров при 25 градусах Цельсия на три часа в темноте. После прививки положите саженцы табака на новые чашки Петри с 10 миллилитрами стерильной воды, погружая корни. Держите корни влажными, покрыв двумя кусочками фильтровальной бумаги.
Держите посуду при температуре 25 градусов по Цельсию 16-часовой световой / восьмичасовой темный период фото. Через два-три дня наблюдают тяжесть заболевания. Для контрольной обработки положите саженцы табака непосредственно в чашки Петри 10-миллилитровой стерильной воды, погружая корни и накрывая корни двумя кусочками фильтровальной бумаги.
Оценка инфекции Phytophthora nicotianae. Оцените тяжесть заболевания через четыре-пять дней после прививки. Основываясь на китайском национальном стандарте, оцените тяжесть отдельных заболеваний растений по шкале от нуля до девяти.
Степень 0 означает отсутствие симптомов на всем растении. 1 степень означает поражение стебля менее 1/3 обхвата стебля или 1/3 увядания листьев. Сорт 3 означает поражение стебля между 1/3 и 1/2 обхвата стебля или между 1/3 и 1/2 листьев, слегка увядающих.
Степень 5 означает поражения стебля, превышающие 1/2 обхвата стебля, но не полностью вокруг обхвата или между 1/2 и 2/3 увядания листьев. Степень 7 означает поражение стебля вокруг всего обхвата стебля или более 2/3 увядающих листьев. 9 класс означает, что растения выглядят мертвыми.
Рассчитайте индекс заболеваемости по следующей формуле. Тяжесть заболевания была разделена на шесть степеней. Репрезентативные результаты.
Четырехнедельные растения устойчивого сорта BH и восприимчивого сорта XHJ были оспорены Phytophthora nicotianae с использованием метода, представленного в этой статье. Через три дня после прививки в XHJ поражения стебля покрывали примерно 1/2 обхвата стебля и 1/2 листьев были слегка увядшими. У резистентной разновидности BH никаких симптомов не наблюдалось.
Через четыре дня после прививки увядание листьев и тяжелые поражения стеблей происходили в XHJ, тогда как эти симптомы не проявлялись в BH.At через пять дней после прививки, индивидуальная тяжесть заболевания растений была зарегистрирована и рассчитана на основе китайского национального стандарта для сорта и метода исследования табачных заболеваний и насекомых-вредителей. Средний индекс заболевания BH составил 6,48, что показывает резистентность R согласно стандарту, а средний индекс заболевания XHJ составил 76,85, что показывает восприимчивость S согласно стандарту. Чтобы подтвердить эффективность прививки, относительная биомасса патогена была количественно определена с помощью ПЦР в реальном времени.
Результат ПЦР в реальном времени подтверждает фенотипические наблюдения. Пять потомков из популяции BC4 F2 скрещивания между BH и XHJ, двумя промежуточными сортами резистентности, K326 и Yunyan87, были оценены методом инокуляции суспензии зооспор и методом инокуляции овсяных зерен. Метод суспензии зооспоры проводили на мелких саженцах и метод посева овсяных зерен на взрослых растениях.
Для пяти потомков из популяции BC4 F2 индекс заболевания варьировался от 16,49 до 77,60 методом суспензии зооспоры и варьировался от 10,33 до 83,08 по методу овсяных зерен. Классификации резистентности между двумя методами заражения в основном согласуются друг с другом. С двумя промежуточными сортами сопротивления K326 и Yunyan87 оценка показала устойчивость в обоих методах.
Эти данные иллюстрируют корреляцию между двумя методами инокуляции, несмотря на то, что они были выполнены на табаке в разный период роста. Описанный здесь протокол является эффективным и надежным методом оценки устойчивости табака к инфекции стадией P.nicotianae. Этот протокол практичен для селекции, а также для исследования молекулярного механизма, поскольку метод овсяного зерна применим для крупномасштабного скрининга устойчивости взрослых растений.
Эти два метода могут использоваться взаимодополняющими. Спасибо за просмотр.
