هنا ، يتم تقديم بروتوكول للفحص الفعال والدقيق للأنماط الوراثية للتبغ لمقاومة Phytophthora nicotianae في الشتلات. إنه عملي للتربية الدقيقة ، وكذلك أبحاث الآلية الجزيئية. المواد. احصل على أصناف التبغ Beinhart1000-1 ، ومجموعة مختارة من Beinhart1000 BH ، و Xiaohuangjin1025 XHJ من Geneback الوطني متوسط الأجل لمورد البلازما الوراثية للتبغ في الصين.
BH مقاوم ، في حين أن XHJ عرضة لعدوى Phytophthora nicotianae. زراعة الأنماط الوراثية للتبغ لتقييم مقاومة Phytophthora nicotianae. امزج بذور التبغ مع الفيرميكوليت وبث البذور بلطف على تربة الأواني المعقمة.
ضع الأواني في غرفة النمو. حافظ على درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 درجة مئوية تحت فترة ضوء 16 ساعة / ثماني ساعات مظلمة. إعداد الأجهزة المائية مع الصواني وألواح الرغوة.
بعد أن تنبت البذور ، قم بوخز الشتلات من تربة الأصيص. اغسل الجذور بلطف بالماء المعقم منزوع الأيونات وازرعها في الأجهزة المائية. ضع الأجهزة في غرف المناخ عند 25 درجة مئوية تحت ضوء لمدة ست ساعات / ثماني ساعات من فترة الصور المظلمة لمدة 24 ساعة.
تحضير محلول المغذيات Hoagland مسبقا. زرع الشتلات إلى الأجهزة المائية مع محلول المغذيات Hoagland. ضع الأجهزة في غرفة المناخ عند 25 درجة مئوية تحت فترة ضوء 16 ساعة / ثماني ساعات مظلمة لمدة أسبوعين.
إعداد تعليق Phytophthora nicotianae zoospore. إعداد دقيق الشوفان أجار المتوسطة. يزن 33 غراما من دقيق الشوفان في وعاء مجوف ويضاف 1000 ملليلتر من الماء المعقم.
تغلي على فرن كهرومغناطيسي. بعد أن يصبح دقيق الشوفان لزجا ، قم بتصفية السائل من خلال قطعة من الشاش المعقم. صب السائل في اسطوانة متدرجة 1000 ملليلتر واضبط الحجم على 1000 ملليلتر بالماء المعقم.
صب السائل في زجاجة كاشف زجاجي وإضافة 18 غراما من الأجار. يرج جيدا ويعتم خليط أجار الشوفان المتوسط عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
صب حوالي 20 ملليلتر من أجار الشوفان المعقم في كل طبق بتري. اترك أطباق بتري في درجة حرارة الغرفة لتبرد جيدا قبل زراعة الميسيل. زراعة الميسيل.
قم بإعداد لكمات وأعواد أسنان قطرها سنتيمتر واحد مسبقا عن طريق تعقيمها في الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثقوب لكمة في ثقافات Phytophthora nicotianae mycelial agar لصنع حصير mycelial مستدير. اختر الحصير الفطري ، وضع الجانب الفطري لأسفل على وسط أجار الشوفان واحتضن الميسيليوم عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 14 يوما.
إعداد تعليق Phytophthora nicotianae zoospore. أضف محلول نترات البوتاسيوم بنسبة 0.1٪ إلى كل زراعة فطرية 15 ملليلتر لكل طبق ، تليها الزراعة عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لحث البوغ. حافظ على الأطباق عند 25 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة لإطلاق جراثيم الحيوانات.
جمع تعليق zoospore إلى كوب وقياس تركيز zoospore عن طريق المجهر ومقياس الدم. اضبط تركيز الجراثيم الحيوانية على 10 مرات إلى جراثيم الحيوان الرابع لكل ملليلتر بالماء المعقم. تحديد أصناف التبغ المقاومة للأمراض.
خذ الشتلات من محلول المغذيات Hoagland وتلقيحها عن طريق غمر الجذور في 20 ملليلتر من تعليق Phytophthora nicotianae zoospore في طبق بتري 90 ملم عند 25 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات في الظلام. بعد التلقيح ، ضع شتلات التبغ في أطباق بتري الجديدة مع 10 ملليلتر من الماء المعقم ، وغمر الجذور. حافظ على رطوبة الجذور عن طريق تغطيتها بقطعتين من ورق الترشيح.
احتفظ بالأطباق في 25 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ضوئية / ثماني ساعات من الصور المظلمة. بعد يومين إلى ثلاثة أيام ، لاحظ شدة المرض. لعلاج المكافحة ، ضع شتلات التبغ مباشرة في أطباق بتري بماء معقم 10 ملليلتر ، وغمر الجذور وقم بتغطية الجذور بقطعتين من ورق الترشيح.
تقييم عدوى Phytophthora nicotianae. تقييم شدة المرض بعد أربعة إلى خمسة أيام من التلقيح. استنادا إلى المعيار الوطني الصيني ، سجل شدة الأمراض النباتية الفردية على مقياس من صفر إلى تسعة.
الصف 0 يعني عدم وجود أعراض على النبات بأكمله. الصف الأول يعني الآفات الجذعية أقل من 1/3 من محيط الساق أو 1/3 من أوراق الذبول. الصف 3 يعني الآفات الجذعية بين 1/3 و 1/2 من محيط الساق أو بين 1/3 و 1/2 من الأوراق التي تذبل قليلا.
الصف 5 يعني الآفات الجذعية أكبر من 1/2 من محيط الساق ، ولكن ليس تماما حول محيط أو بين 1/2 و 2/3 من أوراق الذبول. الصف 7 يعني الآفات الجذعية حول محيط الجذع الكامل أو أكبر من 2/3 من أوراق الذبول. الصف 9 يعني أن النباتات تبدو ميتة.
احسب مؤشر المرض باستخدام الصيغة التالية. تم تقسيم شدة المرض إلى ست درجات. النتائج التمثيلية.
تم تحدي النباتات البالغة من العمر أربعة أسابيع من الصنف المقاوم BH والصنف الحساس XHJ مع Phytophthora nicotianae باستخدام الطريقة المعروضة في هذه المقالة. في ثلاثة أيام بعد التلقيح ، في XHJ ، غطت الآفات الجذعية حوالي 1/2 من محيط الساق و 1/2 من الأوراق كانت ذابلة قليلا. في الصنف المقاوم BH ، لم تلاحظ أي أعراض.
في أربعة أيام بعد التلقيح ، حدث ذبول الأوراق والآفات الجذعية الشديدة في XHJ في حين أن هذه الأعراض لم تظهر في BH.At خمسة أيام بعد التلقيح ، تم تسجيل شدة الأمراض النباتية الفردية وحسابها بناء على المعيار الوطني الصيني لطريقة الصف والتحقيق في أمراض التبغ والآفات الحشرية. كان متوسط مؤشر المرض ل BH 6.48 ، والذي يظهر المقاومة R وفقا للمعيار ، وكان متوسط مؤشر المرض ل XHJ 76.85 ، مما يدل على القابلية S وفقا للمعيار. لتأكيد كفاءة التلقيح ، تم تحديد الكتلة الحيوية المسببة للأمراض النسبية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.
تؤكد نتيجة PCR في الوقت الفعلي ملاحظات النمط الظاهري. تم تقييم خمسة ذرية من مجموعة BC4 F2 من تقاطع بين BH و XHJ ، وهما نوعان من المقاومة الوسيطة ، K326 و Yunyan87 ، بواسطة طريقة تلقيح تعليق بوغ الحيوان وطريقة تلقيح حبوب الشوفان. تم تنفيذ طريقة تعليق Zoospore على الشتلات الصغيرة وتم تنفيذ طريقة تلقيح حبوب الشوفان على النباتات البالغة.
بالنسبة للأسلاف الخمسة من سكان BC4 F2 ، تراوح مؤشر المرض من 16.49 إلى 77.60 بطريقة تعليق الجراثيم الحيوانية وتراوح من 10.33 إلى 83.08 بطريقة حبوب الشوفان. تتوافق تصنيفات المقاومة بين طريقتين للعدوى في الغالب مع بعضها البعض. مع نوعي المقاومة الوسيطة K326 و Yunyan87 ، أظهر التقييم مقاومة في كلتا الطريقتين.
توضح هذه البيانات العلاقة بين طريقتين للتلقيح على الرغم من أنهما أجريتا على التبغ في فترة نمو مختلفة. البروتوكول الموصوف هنا هو طريقة فعالة وموثوقة لتقييم مقاومة التبغ للعدوى بواسطة مرحلة شتلات P.nicotianae. هذا البروتوكول عملي للتكاثر وكذلك لأبحاث الآلية الجزيئية حيث أن طريقة حبوب الشوفان قابلة للتطبيق على فحص المقاومة على نطاق واسع للنباتات البالغة.
يمكن لهذه الطريقتين استخدام تكميلي. شكرا للمشاهدة.
