Ici, un protocole est présenté pour le dépistage efficace et précis des génotypes de tabac pour la résistance à Phytophthora nicotianae chez les semis. Il est pratique pour la sélection de précision, ainsi que pour la recherche sur les mécanismes moléculaires. Matériaux. Obtenez les variétés de tabac Beinhart1000-1, une sélection de Beinhart1000 BH et Xiaohuangjin1025 XHJ à partir du Geneback national à moyen terme de la ressource génétique du tabac de Chine.
BH est résistant, tandis que XHJ est sensible à l’infection à Phytophthora nicotianae. Planter des génotypes de tabac pour l’évaluation de la résistance à Phytophthora nicotianae. Mélanger les graines de tabac avec de la vermiculite et diffuser doucement les graines sur le terreau stérilisé.
Placez les pots dans la chambre de croissance. Maintenez une température constante de 25 degrés Celsius sous une période de photo de 16 heures de lumière / huit heures d’obscurité. Préparez des appareils hydroponiques avec des plateaux et des feuilles de mousse.
Après la germination des graines, piquez les semis hors du terreau. Lavez doucement les racines avec de l’eau désionisée stérile et transplantez-les dans les appareils hydroponiques. Placez les appareils dans des chambres climatiques à 25 degrés Celsius sous une période photo de six heures de lumière / huit heures d’obscurité pendant 24 heures.
Préparez la solution nutritive Hoagland à l’avance. Transplantez les semis dans des dispositifs hydroponiques avec une solution nutritive Hoagland. Placez les appareils dans la chambre climatique à 25 degrés Celsius sous une période photo de 16 heures de lumière / huit heures d’obscurité pendant deux semaines.
Préparation de Phytophthora nicotianae zoospore suspension. Préparation du milieu de gélose à l’avoine. Peser 33 grammes de flocons d’avoine dans un creux et ajouter 1 000 millilitres d’eau stérile.
Faire bouillir sur un four électromagnétique. Une fois que la farine d’avoine devient collante, filtrez le liquide à travers un morceau de gaze stérile. Versez le liquide dans un cylindre gradué de 1 000 millilitres et réglez le volume à 1 000 millilitres avec de l’eau stérile.
Versez le liquide dans un flacon de réactif en verre et ajoutez 18 grammes de gélose. Bien agiter et autoclaver le mélange de gélose à l’avoine à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Laissez-le à température ambiante pendant 30 minutes.
Versez environ 20 millilitres de matière à farine d’avoine stérilisée dans chaque boîte de Pétri. Laissez les boîtes de Petri à température ambiante refroidir soigneusement avant la culture mycélienne. Culture mycélienne.
Préparez au préalable des poinçons et des cure-dents d’un centimètre de diamètre en les autoclavant dans un autoclave à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Percez des trous dans les cultures de gélose mycélienne Phytophthora nicotianae pour faire des tapis mycéliens ronds. Choisissez des tapis mycéliens, placez le côté mycélien vers le bas sur un milieu de gélose à l’avoine et incubez le mycélium à 25 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 14 jours.
Préparation de Phytophthora nicotianae zoospore suspension. Ajouter 0,1% de solution de nitrate de potassium à chaque culture mycélienne 15 millilitres par plat, puis cultiver à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour induire le sporange. Gardez les plats à 25 degrés Celsius pendant 25 minutes pour libérer les zoospores.
Recueillir la suspension de zoospore dans un bécher et mesurer la concentration de zoospore au microscope et à l’hémocytomètre. Ajuster la concentration de zoospore à une fois 10 à la quatrième zoospore par millilitre avec de l’eau stérile. Identification des variétés de tabac résistantes aux maladies.
Prenez des semis de la solution nutritive Hoagland et inoculez-les en immergeant les racines dans 20 millilitres de suspension de zoospore Phytophthora nicotianae dans une boîte de Pétri de 90 millimètres à 25 degrés Celsius pendant trois heures dans l’obscurité. Après l’inoculation, mettez les plants de tabac dans de nouvelles boîtes de Pétri avec 10 millilitres d’eau stérile, en immergeant les racines. Gardez les racines humides en les recouvrant de deux morceaux de papier filtre.
Gardez la vaisselle à 25 degrés Celsius 16 heures de lumière / huit heures d’obscurité période photo. Après deux à trois jours, observez la gravité de la maladie. Pour le traitement de contrôle, mettez les plants de tabac directement dans les boîtes de Petri avec de l’eau stérile de 10 millilitres, en immergeant les racines et en recouvrant les racines de deux morceaux de papier filtre.
Évaluation de l’infection à Phytophthora nicotianae. Évaluer la gravité de la maladie quatre à cinq jours après l’inoculation. Sur la base de la norme nationale chinoise, évaluez la gravité des maladies des plantes sur une échelle de zéro à neuf.
Grade 0 signifie aucun symptôme sur l’ensemble de la plante. Grade 1 signifie lésions de la tige inférieures à 1/3 de la circonférence de la tige ou 1/3 des feuilles flétrissantes. Le grade 3 signifie des lésions de tige comprises entre 1/3 et 1/2 de la circonférence de la tige ou entre 1/3 et 1/2 des feuilles légèrement fanées.
Grade 5 signifie des lésions de tige supérieures à 1/2 de la circonférence de la tige, mais pas complètement autour de la circonférence ou entre 1/2 et 2/3 des feuilles qui flétrissent. Le grade 7 signifie des lésions de tige autour de la circonférence de la tige entière ou plus de 2/3 des feuilles flétrissantes. Le grade 9 signifie que les plantes ont l’air mortes.
Calculez l’indice de maladie à l’aide de la formule suivante. La gravité de la maladie a été divisée en six grades. Résultats représentatifs.
Les plantes âgées de quatre semaines de la variété résistante BH et de la variété sensible XHJ ont été confrontées à Phytophthora nicotianae en utilisant la méthode présentée dans cet article. Trois jours après l’inoculation, dans XHJ, les lésions de la tige couvraient environ 1/2 de la circonférence de la tige et 1/2 des feuilles étaient légèrement fanées. Dans la variété résistante BH, aucun symptôme n’a été observé.
Quatre jours après l’inoculation, le flétrissement des feuilles et les lésions graves de la tige sont survenus dans XHJ alors que ces symptômes n’apparaissaient pas dans BH.At cinq jours après l’inoculation, la gravité individuelle des maladies des plantes a été enregistrée et calculée sur la base de la norme nationale chinoise pour la qualité et la méthode d’investigation des maladies du tabac et des insectes nuisibles. L’indice moyen de maladie de BH était de 6,48, ce qui montre la résistance R selon la norme, et l’indice moyen de maladie de XHJ était de 76,85, ce qui montre la susceptibilité S selon la norme. Pour confirmer l’efficacité de l’inoculation, la biomasse pathogène relative a été quantifiée par PCR en temps réel.
Le résultat de la PCR en temps réel confirme les observations phénotypiques. Cinq descendants de la population BC4 F2 d’un croisement entre BH et XHJ, deux variétés à résistance intermédiaire, K326 et Yunyan87, ont été évalués par la méthode d’inoculation en suspension de zoospore et la méthode d’inoculation des grains d’avoine. La méthode de suspension de Zoospore a été réalisée sur de petits plants et la méthode d’inoculation de grains d’avoine a été effectuée sur des plantes adultes.
Pour les cinq descendants de la population BC4 F2, l’indice de maladie variait de 16,49 à 77,60 par la méthode de suspension de zoospore et variait de 10,33 à 83,08 par la méthode des grains d’avoine. Les classifications de résistance entre deux méthodes d’infection sont pour la plupart cohérentes l’une avec l’autre. Avec les deux variétés de résistance intermédiaire K326 et Yunyan87, l’évaluation a montré une résistance dans les deux méthodes.
Ces données illustrent la corrélation entre deux méthodes d’inoculation bien qu’elles aient été effectuées sur du tabac au cours de différentes périodes de croissance. Le protocole décrit ici est une méthode efficace et fiable pour évaluer la résistance du tabac à l’infection par le stade de semis de P.nicotianae. Ce protocole est pratique pour la sélection ainsi que pour la recherche sur les mécanismes moléculaires, car la méthode du grain d’avoine est applicable au dépistage de la résistance à grande échelle des plantes adultes.
Ces deux méthodes peuvent être complémentaires. Merci d’avoir regardé.
