Qui viene presentato un protocollo per lo screening efficiente e accurato dei genotipi del tabacco per la resistenza a Phytophthora nicotianae nelle piantine. È pratico per l'allevamento di precisione, così come per la ricerca sui meccanismi molecolari. Materiali. Ottieni le varietà di tabacco Beinhart1000-1, una selezione di Beinhart1000 BH e Xiaohuangjin1025 XHJ dal National Medium-term Geneback of the Tobacco Germplasm Resource of China.
BH è resistente, mentre XHJ è suscettibile all'infezione da Phytophthora nicotianae. Piantare genotipi di tabacco per la valutazione della resistenza a Phytophthora nicotianae. Mescolare i semi di tabacco con la vermiculite e trasmettere delicatamente i semi sul terriccio sterilizzato.
Posiziona i vasi nella camera di crescita. Mantenere una temperatura costante di 25 gradi Celsius sotto un periodo di luce di 16 ore / otto ore di foto scure. Preparare dispositivi idroponici con vassoi e fogli di schiuma.
Dopo che i semi germinano, pungere le piantine dal terriccio. Lavare delicatamente le radici con acqua deionizzata sterile e trapiantarle nei dispositivi idroponici. Posizionare i dispositivi in camere climatiche a 25 gradi Celsius sotto un periodo di foto di luce di sei ore / otto ore di buio per 24 ore.
Preparare in anticipo la soluzione nutritiva Hoagland. Trapiantare le piantine in dispositivi idroponici con soluzione nutritiva Hoagland. Posizionare i dispositivi nella camera climatica a 25 gradi Celsius sotto il periodo di luce di 16 ore / otto ore di foto scure per due settimane.
Preparazione di Phytophthora nicotianae zoospore sospensione. Preparazione di agar di farina d'avena media. Pesare 33 grammi di farina d'avena in un hollowware e aggiungere 1.000 millilitri di acqua sterile.
Far bollire su un forno elettromagnetico. Dopo che la farina d'avena diventa appiccicosa, filtrare il liquido attraverso un pezzo di garza sterile. Versare il liquido in un cilindro graduato da 1.000 millilitri e regolare il volume a 1.000 millilitri con acqua sterile.
Versare il liquido in una bottiglia di reagente di vetro e aggiungere 18 grammi di agar. Agitare bene e autoclave la miscela di agar di farina d'avena media a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Versare circa 20 millilitri di agar medio di farina d'avena sterilizzato in ogni piatto di Petri. Lasciare raffreddare accuratamente le piastre di Petri a temperatura ambiente prima della coltivazione miceliale. Coltivazione miceliale.
Preparare in anticipo punzoni e stuzzicadenti di un centimetro di diametro autoclavandoli in autoclave a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Forare i fori nelle colture di agar miceliale Phytophthora nicotianae per realizzare stuoie miceliali rotonde. Scegli le stuoie miceliali, posiziona il lato miceliale verso il basso sul mezzo di agar di farina d'avena e incuba il micelio a 25 gradi Celsius al buio per 14 giorni.
Preparazione di Phytophthora nicotianae zoospore sospensione. Aggiungere la soluzione di nitrato di potassio allo 0,1% a ciascuna coltivazione miceliale 15 millilitri per piatto, seguita da coltivazione a quattro gradi Celsius per 20 minuti per indurre lo sporangio. Mantenere i piatti a 25 gradi Celsius per 25 minuti per rilasciare zoospore.
Raccogliere la sospensione di zoospore in un becher e misurare la concentrazione di zoospore al microscopio e all'emocitometro. Regolare la concentrazione di zoospore a una volta 10 alla quarta zoospora per millilitro con acqua sterile. Identificazione delle varietà di tabacco resistenti alle malattie.
Prendi le piantine dalla soluzione nutritiva di Hoagland e inoculale immergendo le radici in 20 millilitri di sospensione zoospora di Phytophthora nicotianae in una capsula di Petri da 90 millimetri a 25 gradi Celsius per tre ore al buio. Dopo l'inoculazione, mettere le piantine di tabacco in nuove piastre di Petri con 10 millilitri di acqua sterile, immergendo le radici. Mantenere le radici umide coprendo con due pezzi di carta da filtro.
Mantieni i piatti a 25 gradi Celsius 16 ore di luce / otto ore di buio periodo fotografico. Dopo due o tre giorni, osservare la gravità della malattia. Per il trattamento di controllo, mettere le piantine di tabacco direttamente nelle piastre di Petri con acqua sterile da 10 millilitri, immergendo le radici e coprendo le radici con due pezzi di carta da filtro.
Valutazione dell'infezione da Phytophthora nicotianae. Valutare la gravità della malattia da quattro a cinque giorni dopo l'inoculazione. Sulla base dello standard nazionale cinese, valutare la gravità della malattia individuale delle piante su una scala da zero a nove.
Grado 0 significa nessun sintomo su tutta la pianta. Grado 1 indica lesioni dello stelo inferiori a 1/3 della circonferenza dello stelo o 1/3 delle foglie che appassiscono. Grado 3 indica lesioni dello stelo tra 1/3 e 1/2 della circonferenza dello stelo o tra 1/3 e 1/2 delle foglie leggermente appassite.
Grado 5 indica lesioni dello stelo superiori a 1/2 della circonferenza dello stelo, ma non completamente intorno alla circonferenza o tra 1/2 e 2/3 delle foglie che appassiscono. Grado 7 indica lesioni dello stelo intorno alla circonferenza dell'intero stelo o superiori a 2/3 delle foglie che appassiscono. Il grado 9 significa che le piante sembrano morte.
Calcola l'indice di malattia usando la seguente formula. La gravità della malattia era divisa in sei gradi. Risultati rappresentativi.
Le piante di quattro settimane della varietà resistente BH e della varietà sensibile XHJ sono state sfidate con Phytophthora nicotianae utilizzando il metodo presentato in questo articolo. A tre giorni dopo l'inoculazione, in XHJ, le lesioni dello stelo coprivano circa 1/2 della circonferenza del gambo e 1/2 delle foglie erano leggermente appassite. Nella varietà resistente BH, non sono stati osservati sintomi.
A quattro giorni dall'inoculazione, l'avvizzimento delle foglie e le gravi lesioni dello stelo si sono verificati in XHJ, mentre questi sintomi non sono comparsi in BH.At cinque giorni dopo l'inoculazione, la gravità della malattia individuale delle piante è stata registrata e calcolata in base allo standard nazionale cinese per il grado e il metodo di indagine delle malattie del tabacco e degli insetti nocivi. L'indice medio di malattia di BH era 6,48, che mostra resistenza R secondo lo standard, e l'indice medio di malattia di XHJ era 76,85, che mostra la suscettibilità S secondo lo standard. Per confermare l'efficienza dell'inoculazione, la biomassa patogena relativa è stata quantificata mediante PCR in tempo reale.
Il risultato della REAL TIME PCR conferma le osservazioni fenotipiche. Cinque progenie della popolazione BC4 F2 di un incrocio tra BH e XHJ, due varietà a resistenza intermedia, K326 e Yunyan87, sono state valutate con il metodo di inoculazione in sospensione di zoospore e il metodo di inoculazione dei chicchi d'avena. Il metodo di sospensione delle zoospore è stato eseguito su piccole piantine e il metodo di inoculazione dei chicchi d'avena è stato eseguito su piante adulte.
Per le cinque progenie della popolazione BC4 F2, l'indice di malattia variava da 16,49 a 77,60 con il metodo di sospensione delle zoospore e variava da 10,33 a 83,08 con il metodo dei chicchi d'avena. Le classificazioni di resistenza tra due metodi di infezione sono per lo più coerenti tra loro. Con le due varietà di resistenza intermedia K326 e Yunyan87, la valutazione ha mostrato resistenza in entrambi i metodi.
Questi dati illustrano la correlazione tra due metodi di inoculazione nonostante siano stati eseguiti sul tabacco in diversi periodi di crescita. Il protocollo qui descritto è un metodo efficiente e affidabile per valutare la resistenza del tabacco all'infezione da parte dello stadio di piantina di P.nicotianae. Questo protocollo è pratico per l'allevamento e per la ricerca sui meccanismi molecolari in quanto il metodo del grano d'avena è applicabile per lo screening di resistenza su larga scala di piante adulte.
Questi due metodi possono essere utilizzati in modo complementare. Grazie per l'attenzione.
