Burada, fidelerde Phytophthora nicotianae direnci için tütün genotiplerinin etkili ve doğru bir şekilde taranması için bir protokol sunulmaktadır. Hassas ıslahın yanı sıra moleküler mekanizma araştırması için pratiktir. Malzeme. Tütün çeşitleri Beinhart1000-1, Beinhart1000 BH ve Xiaohuangjin1025 XHJ bir seçim Çin Tütün Germplazma Kaynağının Ulusal Orta Vadeli Geneback'inden elde edin.
BH dirençlidir, oysa XHJ Phytophthora nicotianae enfeksiyonuna duyarlıdır. Phytophthora nicotianae direnç değerlendirmesi için tütün genotiplerinin ekilmesi. Tütün tohumlarını vermikülit ile karıştırın ve tohumları sterilize edilmiş saksı toprağına yavaşça yayınlayın.
Saksıları büyüme odasına yerleştirin. 16 saatlik ışık/sekiz saatlik karanlık fotoğraf süresi altında 25 santigrat derecelik sabit bir sıcaklık sağlayın. Hidroponik cihazları tepsiler ve köpük tabakalarla hazırlayın.
Tohumlar çimlendikten sonra, fideleri saksı toprağından çıkarın. Kökleri steril deiyonize suyla nazikçe yıkayın ve hidroponik cihazlara nakledin. Cihazları iklim odalarına 24 saat boyunca altı saatlik ışık / sekiz saatlik karanlık fotoğraf periyodu altında 25 santigrat derecede yerleştirin.
Hoagland besin çözeltisini önceden hazırlayın. Fideleri Hoagland besin çözeltisi ile hidroponik cihazlara nakledin. Cihazları iki hafta boyunca 16 saatlik ışık / sekiz saatlik karanlık fotoğraf periyodu altında 25 santigrat derecede iklim odasına yerleştirin.
Phytophthora nicotianae zoospor süspansiyonunun hazırlanması. Yulaf ezmesi agar ortamının hazırlanması. 33 gram yulaf ezmesini içi boş bir kap içine tartın ve 1.000 mililitre steril su ekleyin.
Elektromanyetik bir fırında kaynatın. Yulaf ezmesi yapışkan hale geldikten sonra, sıvıyı bir parça steril gazlı bezden süzün. Sıvıyı 1.000 mililitrelik dereceli bir silindire dökün ve cildi steril suyla 1.000 mililitreye ayarlayın.
Sıvıyı bir cam reaktif şişesine dökün ve 18 gram agar ekleyin. İyice çalkalayın ve karışımı yulaf ezmesi agar ortamını 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklav. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
Her Petri kabına yaklaşık 20 mililitre sterilize yulaf ezmesi agar ortamı dökün. Petri kaplarını misel ekiminden önce iyice soğuması için oda sıcaklığında bırakın. Misel yetiştiriciliği.
Bir santimetre çapında zımbaları ve kürdanları 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede bir otoklavda otoklavlayarak önceden hazırlayın. Yuvarlak misel paspasları yapmak için Phytophthora nicotianae misel agar kültürlerinde delikler açın. Misel paspaslarını seçin, misel tarafını yulaf ezmesi agar ortamına yerleştirin ve miselyumu 14 gün boyunca karanlıkta 25 santigrat derecede inkübe edin.
Phytophthora nicotianae zoospor süspansiyonunun hazırlanması. Her misel yetiştiriciliğine çanak başına 15 mililitre % 0.1 potasyum nitrat çözeltisi ekleyin, ardından sporangium'u indüklemek için 20 dakika boyunca dört santigrat derecede kültürlenin. Zoosporları serbest bırakmak için bulaşıkları 25 dakika boyunca 25 santigrat derecede tutun.
Zoospor süspansiyonunu bir beher'e toplayın ve zoospor konsantrasyonunu mikroskop ve hemositometre ile ölçün. Zoospor konsantrasyonunu steril su ile mililitre başına bir kez 10 ila dördüncü zoospor arasında ayarlayın. Hastalığa dayanıklı tütün çeşitlerinin tanımlanması.
Hoagland besin çözeltisinden fideleri alın ve kökleri karanlıkta üç saat boyunca 25 santigrat derecede 90 milimetrelik bir Petri kabında 20 mililitre Phytophthora nicotianae zoospor süspansiyonuna batırarak aşılayın. Aşılamadan sonra, tütün fidelerini kökleri batırarak 10 mililitre steril su ile yeni Petri kaplarına koyun. İki parça filtre kağıdı ile kaplayarak kökleri nemli tutun.
Bulaşıkları 25 santigrat derece 16 saatlik ışık / sekiz saatlik karanlık fotoğraf periyodunda saklayın. İki ila üç gün sonra, hastalığın şiddetini gözlemleyin. Kontrol işlemi için, tütün fidelerini doğrudan Petri kaplarına 10 mililitre steril suyla koyun, kökleri daldırın ve kökleri iki parça filtre kağıdı ile örtün.
Phytophthora nicotianae enfeksiyonunun değerlendirilmesi. Aşılamadan dört ila beş gün sonra hastalığın şiddetini değerlendirin. Çin ulusal standardına dayanarak, bireysel bitki hastalığı şiddetini sıfırdan dokuza kadar bir ölçekte puanlayın.
Derece 0, tüm bitkide semptom olmadığı anlamına gelir. Derece 1, kök çevresinin 1 / 3'ünden daha az kök lezyonları veya yaprakların 1 / 3'ünün solması anlamına gelir. Derece 3, kök çevresinin 1/3 ila 1/2'si arasında veya yaprakların 1/3 ila 1/2'si arasında hafif solgunluk yapan kök lezyonları anlamına gelir.
Derece 5, kök çevresinin 1 / 2'sinden daha büyük, ancak çevrenin etrafında tamamen olmayan veya yaprakların 1/2 ila 2/3'ü arasında solan kök lezyonları anlamına gelir. Derece 7, tüm kök çevresi etrafındaki kök lezyonları veya yaprakların 2 / 3'ünden daha fazla solgunluk anlamına gelir. 9. sınıf, bitkilerin ölü göründüğü anlamına gelir.
Aşağıdaki formülü kullanarak hastalık indeksini hesaplayın. Hastalığın şiddeti altı sınıfa ayrıldı. Temsili sonuçlar.
Dirençli BH ve duyarlı XHJ çeşidinin dört haftalık bitkileri, bu makalede sunulan yöntem kullanılarak Phytophthora nicotianae ile sorgulandı. Aşılamadan üç gün sonra, XHJ'de, kök lezyonları kök çevresinin yaklaşık 1 / 2'sini kapladı ve yaprakların 1 / 2'si hafifçe soldu. Dirençli BH çeşidinde herhangi bir semptom gözlenmedi.
Aşılamadan dört gün sonra, XHJ'de yaprak solgunluğu ve ciddi kök lezyonları meydana gelirken, bu semptomlar aşılamadan sonraki beş gün BH.At ortaya çıkmazken, bireysel bitki hastalığı şiddeti, tütün hastalıkları ve böcek zararlılarının derecesi ve araştırma yöntemi için Çin ulusal standardına dayanarak kaydedildi ve hesaplandı. BH'nin ortalama hastalık indeksi standarda göre direnç R gösteren 6.48 ve XHJ'nin ortalama hastalık indeksi 76.85 idi ve bu da standarda göre duyarlılık S'yi gösterdi. Aşılama etkinliğini doğrulamak için, göreceli patojen biyokütlesi gerçek zamanlı PCR ile ölçüldü.
Gerçek zamanlı PCR'nin sonucu fenotipik gözlemleri doğrulamaktadır. BH ve XHJ arasındaki bir haç BC4 F2 popülasyonundan beş soy, iki ara direnç çeşidi, K326 ve Yunyan87, zoospor süspansiyon aşılama yöntemi ve yulaf taneleri aşılama yöntemi ile değerlendirildi. Küçük fidelerde zoospor süspansiyon yöntemi, yetişkin bitkilerde yulaf taneleri aşılama yöntemi uygulanmıştır.
BC4 F2 popülasyonundan beş soy için, hastalık indeksi zoospor süspansiyon yöntemi ile 16.49 ila 77.60 arasında ve yulaf taneleri yöntemi ile 10.33 ila 83.08 arasında değişmiştir. İki enfeksiyon yöntemi arasındaki direnç sınıflamaları çoğunlukla birbiriyle tutarlıdır. İki ara direnç çeşidi K326 ve Yunyan87 ile yapılan değerlendirme, her iki yöntemde de direnç gösterdi.
Bu veriler, farklı büyüme dönemlerinde tütün üzerinde yapılmış olmalarına rağmen iki aşılama yöntemi arasındaki korelasyonu göstermektedir. Burada açıklanan protokol, tütünün enfeksiyona karşı direncini P.nicotianae fide aşaması ile değerlendirmek için etkili ve güvenilir bir yöntemdir. Bu protokol, yulaf tanesi yöntemi yetişkin bitkilerin büyük ölçekli direnç taraması için geçerli olduğu için ıslahın yanı sıra moleküler mekanizma araştırmaları için de pratiktir.
Bu iki yöntemi tamamlayıcı olarak kullanabilir. İzlediğiniz için teşekkürler.
