פרוטוקול זה מספק התייחסות לבנייה ואפיון של מערכות צביעה תגובתיות לצילום, במיוחד התקנה של קרינת אור. טכניקה זו מראה את היתרון של ייצור פשוט, יכולת העמסת תרופות גבוהה ויכולת שליטה בתמונות. טכניקה זו יכולה לשמש לטיפול בגידול המעי הגס בעזרת סיב אופטי כדי לספק אורות להפעלת שחרור התרופה באתר הגידול.
התחל בשקילת 10 מיליגרם של בורון dipyrromethene chlorambucil או BC prodrug והמיס אותו במיליליטר אחד של dimethyl sulfoxide, או DMSO, בצינור מיקרו 1.5 מיליליטר. כסו את תמיסת BC בנייר כסף, הכינו 0.4 מיליגרם למיליליטר IR783 במים מסוננים שעברו דה-יוניזציה, והעבירו 300 מיקרוליטר בצינור מיקרו של 1.5 מיליליטר. הניחו את צינור המיקרו הזה על מערבל מערבולות במהירות של 1500 סל"ד.
לאחר מכן, כאשר קצה הפיפטה של 20 מיקרוליטר נוגע בדופן הפנימית של צינור המיקרו, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת BC לתמיסת IR783 במשך 10 שניות בקצב קבוע. הניחו את צינור המיקרו על מערבל המערבולת למשך 30 שניות כדי לקבל את חלקיקי IR783/BC. לאחר מכן הניחו את תמיסת הננו-חלקיקים על מדף מכוסה במלואו בנייר כסף.
צנטריפוגו את תמיסת הננו-חלקיקים IR783/BC המתקבלת למשך 10 דקות ב-2000 G וארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר אגרגטים. אספו את הסופרנטנט, השאירו כ-20 מיקרוליטר בצינור כדי למנוע הפרעה לגלולה לפני השלכתה. לאחר צנטריפוגה של הסופרנאטנט פעמיים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 30, 000 גרם ו-4 מעלות צלזיוס, אספו את משקע הננו-חלקיקים משתי הצנטריפיקציות.
להשהות מחדש את הננו-חלקיקים ב-300 מיקרוליטר של PBS. כמת את התוכן של IR783 ו- BC באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, או HPLC, באמצעות שיטת elution. חשב את יעילות האנקפסולציה של פרו-תרופות, או אחוז EE, ואת קיבולת ההעמסה או, אחוז LC.
למדוד את הגודל הממוצע של ננו-חלקיקי IR783/BC באמצעות מכשיר פיזור אור דינמי, או DLS. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת ננו-חלקיקים IR783/BC בקובטה והכנס את הקובטה למחזיק למדידה. הגדר את סוג המדידה כגודל ואת טמפרטורת המדידה כ- 25 מעלות צלזיוס.
בצע שלוש מדידות עם משך של 20 שניות לכל מדידה. כדי למדוד את מטען פני השטח של חלקיקי IR783/BC באמצעות מכשיר DLS, דלל 25 מיקרוליטר של תמיסת ננו-חלקיקים IR783/BC עם 725 מיקרוליטר מים שעברו דה-יוניזציה בצינור מיקרו של 1.5 מיליליטר. הוסף את הפתרון לתוך cuvette בדיקה פוטנציאלית zeta.
מניחים את הקובט בחריץ הדגימה. מכסים את חריץ הדגימה. לאחר מכן, הגדר את סוג המדידה כפוטנציאל זטה ואת הטמפרטורה כ- 25 מעלות צלזיוס.
בצע 10 מדידות. לאחר שתסיים, הכינו את הדגימות להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, או TEM, על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של תמיסת ננו-חלקיקים IR783/BC על פיסת סרט פחמן חורי ברשת נחושת של 300 רשת והסרת שבעה מיקרוליטרים מסרט הפחמן החור. השאירו שלושה מיקרוליטרים של תמיסה על הסרט למשך הלילה לאידוי אוטומטי.
התקינו מנורת לד בגודל 530 ננומטר עם מעמד ברזל כך שהאור יפנה ישירות לרצפת ההפעלה. מקם פוטודיודה כדורית משולבת ישירות מתחת למנורת ה-LED. הפעל את מנורת ה- LED ופתח את מכסה הפוטומטר.
הקלט את הקרן. הגדר את פרמטרי המנורה באמצעות התוכנה המשויכת והתאם את זרם הכניסה במיליאמפר כדי להגדיר את הקרינה כ- 50 מילי וואט לסמ"ר. לדלל את תמיסת הננו-חלקיקים IR783/BC במים שעברו דה-יוניזציה ל-50 מיקרו-מולרית, בהתבסס על ריכוז BC.
הוסף תמיסת ננו-חלקיקים IR783/BC 200 מיקרומולרית למיקרו-צינור של 1.5 מיליליטר. הניחו את הצינור על גוש קצף בעל חריץ המתאים לגודל צינור המיקרו ובאותו גובה כמו הפוטומטר. פתח את מכסה הצינור.
הפעל את מנורת ה-LED והקרן את תמיסת הננו-חלקיקים למשך 1, 2, 3, 5, 7 ו-10 דקות. לאחר הקרנת אור, כמת את צריכת BC ושחרור Cb על ידי HPLC וחשב את שחרור BC ו- Cb הנותרים. ננו-חלקיקי IR783/BC יוצרו בהצלחה במחקר זה בשיטת משקעים בזק.
הננו-חלקיקים המסונתזים היו נוכחים כתמיסה סגולה בעוד התמיסה המימית של IR783 הייתה כחולה. ננו-חלקיקי IR783/BC הציגו גודל ממוצע של 87.22 ננומטר עם אינדקס פיזור רב-תכליתי, או PDI, של 0.089;מה שמדגים התפלגות גודל צרה. מטען פני השטח היה בערך מינוס 29.8 מיליוולט, מה שמצביע על קבוצות סולפונטים טעונות שלילית של IR783.
גודל הננו-חלקיקים נשמר על 85 ננומטר לפחות 48 שעות לאחר הייצור, בעוד שה-PDI שלו נותר פחות מ-0.2. לא נצפה שינוי משמעותי בהתפלגות הגודל ב-0, 24 ו-48 שעות לאחר הייצור. אגרגטים ושברים נצפו לאחר הקרנה קלה יותר.
שינויים בגודל ובפיזור נצפו לאחר שלוש וחמש דקות של הקרנת אור. Prodrug BC צולמה תוך 10 דקות. בינתיים, כלורמבוציל שוחרר עם יעילות התאוששות של כ -22% באותה תקופה.
ננו-חלקיקי IR783/BC הראו ציטוטוקסיות משמעותית על תאי גידול מעי גס אנושיים HCT 116 תחת הקרנת אור ב-530 ננומטר בהשוואה לקבוצה ללא הקרנה. חשוב לגעת בדופן הפנימית של צינור המיקרו בחוזקה עם קצה הפפטידים ולהניח את צינור המיקרו על המערבולת ביציבות.
