Dieses Protokoll bietet eine Referenz für den Aufbau und die Charakterisierung von photoresponsiven Arzneistoff-Farbstoffsystemen, insbesondere für den Aufbau von Lichtstrahlung. Diese Technik zeigt den Vorteil der einfachen Herstellung, der hohen Wirkstoffbeladungskapazität und der Fotokontrollierbarkeit. Diese Technik kann zur Behandlung von kolorektalen Tumoren mit Hilfe von Glasfasern verwendet werden, um Licht zur Aktivierung der Wirkstofffreisetzung an der Tumorstelle abzugeben.
Beginnen Sie mit dem Abwiegen von 10 Milligramm Bordipyrromethenchlorambucil oder BC-Prodrug und lösen Sie es in einem Milliliter Dimethylsulfoxid oder DMSO in einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen auf. Decken Sie die BC-Lösung mit Folie ab, bereiten Sie dann 0,4 Milligramm pro Milliliter IR783 in gefiltertem deionisiertem Wasser vor und füllen Sie 300 Mikroliter in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Legen Sie dieses Mikroröhrchen mit 1500 U/min auf einen Wirbelmischer.
Wenn das Ende der 20-Mikroliter-Pipettenspitze die Innenwand des Mikroröhrchens berührt, geben Sie dann 20 Mikroliter der BC-Lösung über 10 Sekunden mit konstanter Geschwindigkeit in die IR783-Lösung. Legen Sie das Mikroröhrchen für 30 Sekunden auf den Wirbelmischer, um die IR783/BC-Nanopartikel zu erhalten. Legen Sie dann die Nanopartikellösung auf ein vollständig mit Folie bedecktes Gestell.
Zentrifugieren Sie die resultierende IR783/BC-Nanopartikellösung 10 Minuten lang bei 2000 G und vier Grad Celsius, um Aggregate zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand und lassen Sie etwa 20 Mikroliter im Röhrchen, um eine Störung des Pellets zu vermeiden, bevor Sie es entsorgen. Nachdem der Überstand zweimal 30 Minuten lang bei 30.000 G und 4 Grad Celsius zentrifugiert wurde, sammeln Sie den Nanopartikelniederschlag aus beiden Zentrigen.
Resuspendieren Sie die Nanopartikel in 300 Mikrolitern PBS. Quantifizieren Sie den Gehalt an IR783 und BC mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung der Elutionsmethode. Berechnen Sie die Prodrug-Verkapselungseffizienz (EE-Prozent) und die Beladungskapazität (LC-Prozent).
Messung der durchschnittlichen Größe der IR783/BC-Nanopartikel mit einem Instrument zur dynamischen Lichtstreuung (DLS). Geben Sie 200 Mikroliter IR783/BC-Nanopartikellösung in eine Küvette und setzen Sie die Küvette zur Messung in die Halterung ein. Stellen Sie den Messtyp als Größe und die Messtemperatur als 25 Grad Celsius ein.
Führen Sie für jede Messung drei Messungen mit einer Dauer von 20 Sekunden durch. Um die Oberflächenladung der IR783/BC-Nanopartikel mit dem DLS-Gerät zu messen, verdünnen Sie 25 Mikroliter IR783/BC-Nanopartikellösung mit 725 Mikrolitern deionisiertem Wasser in einem 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Geben Sie die Lösung in eine Zetapotenzial-Testküvette.
Setzen Sie die Küvette in die Probennut ein. Verschließen Sie die Probenrille. Als nächstes stellen Sie den Messtyp als Zetapotenzial und die Temperatur als 25 Grad Celsius ein.
Führen Sie 10 Messungen durch. Wenn Sie fertig sind, bereiten Sie die Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor, indem Sie 10 Mikroliter IR783/BC-Nanopartikellösung auf ein Stück des löchrigen Kohlenstofffilms auf einem Kupfergitter von 300 Maschen geben und sieben Mikroliter aus dem löchrigen Kohlenstofffilm entfernen. Lassen Sie drei Mikroliter Lösung über Nacht auf der Folie, damit sie automatisch verdampft.
Stellen Sie eine LED-Lampe bei 530 Nanometern mit einem Eisenständer auf, so dass die Leuchte direkt auf den Operationsboden ausgerichtet ist. Platzieren Sie ein Ulbrichtkugel-Photodiodenphotometer direkt unter der LED-Lampe. Schalten Sie die LED-Lampe ein und öffnen Sie die Kappe des Photometers.
Zeichnen Sie die Bestrahlungsstärke auf. Stellen Sie die Lampenparameter mit der zugehörigen Software ein und stellen Sie den Eingangsstrom im Milliampere ein, um die Bestrahlungsstärke auf 50 Milliwatt pro Quadratzentimeter einzustellen. Verdünnen Sie die IR783/BC-Nanopartikellösung mit deionisiertem Wasser auf 50 Mikromolaren, basierend auf der BC-Konzentration.
Geben Sie 200 mikromolare IR783/BC-Nanopartikellösung in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen. Legen Sie das Röhrchen auf einen Schaumstoffblock mit einer Nut, die der Größe des Mikroröhrchens entspricht und sich auf der gleichen Höhe wie das Photometer befindet. Öffnen Sie die Kappe der Tube.
Schalten Sie die LED-Lampe ein und bestrahlen Sie die Nanopartikellösung 1, 2, 3, 5, 7 und 10 Minuten lang. Quantifizieren Sie nach der Lichtbestrahlung den BC-Verbrauch und die Cb-Freisetzung mittels HPLC und berechnen Sie die verbleibende BC- und Cb-Freisetzung. IR783/BC-Nanopartikel wurden in dieser Studie erfolgreich mit einer Flash-Fällungsmethode hergestellt.
Die synthetisierten Nanopartikel lagen als violette Lösung vor, während die wässrige Lösung von IR783 blau war. Die IR783/BC-Nanopartikel wiesen eine durchschnittliche Größe von 87,22 Nanometern mit einem Polydispersitätsindex (PDI) von 0,089 auf, was eine enge Größenverteilung zeigt. Die Oberflächenladung betrug etwa minus 29,8 Millivolt, was auf die negativ geladenen Sulfonatgruppen von IR783 hinweist.
Die Größe der Nanopartikel wurde nach der Herstellung mindestens 48 Stunden lang bei 85 Nanometern gehalten, während ihr PDI kleiner als 0,2 blieb. 0, 24 und 48 Stunden nach der Herstellung wurde keine signifikante Veränderung der Größenverteilung beobachtet. Aggregate und Fragmente wurden nach leichterer Bestrahlung beobachtet.
Größen- und Verteilungsänderungen wurden nach drei und fünf Minuten Lichteinstrahlung beobachtet. Prodrug BC wurde in 10 Minuten fotogespalten. Währenddessen wurde Chlorambucil mit einer Rückgewinnungseffizienz von rund 22 % im gleichen Zeitraum freigesetzt.
Die IR783/BC-Nanopartikel zeigten eine signifikante Zytotoxizität auf humanen kolorektalen Tumorzellen HCT 116 unter Lichtbestrahlung bei 530 Nanometern im Vergleich zur Nicht-Bestrahlungsgruppe. Es ist wichtig, die Innenwand des Mikroröhrchens mit dem Ende der Peptide fest zu berühren und das Mikroröhrchen stabil auf dem Wirbel zu platzieren.
