Este protocolo proporciona una referencia sobre la construcción y caracterización de sistemas fotosensibles de tinte farmacológico, especialmente la configuración de la radiación de luz. Esta técnica muestra la ventaja de la fabricación simple, la alta capacidad de carga de medicamentos y la fotocontrolabilidad. Esta técnica se puede utilizar para tratar el tumor colorrectal con la ayuda de fibra óptica para administrar luces para activar la liberación del fármaco en el sitio del tumor.
Comience pesando 10 miligramos del clorambucilo de dipironeteno de boro o profármaco BC y disuélvalo en un mililitro de dimetilsulfóxido, o DMSO, en un microtubo de 1.5 mililitros. Cubra la solución de BC con papel de aluminio, luego prepare 0.4 miligramos por mililitro IR783 en agua desionizada filtrada y transfiera 300 microlitros en un microtubo de 1.5 mililitros. Coloque este microtubo en un mezclador de vórtice a 1500 RPM.
A continuación, con el extremo de la punta de la pipeta de 20 microlitros tocando la pared interna del microtubo, agregue 20 microlitros de la solución BC a la solución IR783 durante 10 segundos a una velocidad constante. Coloque el microtubo en el mezclador de vórtice durante 30 segundos para obtener las nanopartículas IR783 / BC. Luego coloque la solución de nanopartículas en un estante completamente cubierto con papel de aluminio.
Centrifugar la solución de nanopartículas IR783/BC resultante durante 10 minutos a 2000 G y cuatro grados centígrados para eliminar los agregados. Recoger el sobrenadante, dejando aproximadamente 20 microlitros en el tubo para evitar alterar el pellet antes de desecharlo. Después de centrifugar el sobrenadante dos veces durante 30 minutos a 30, 000 G y 4 grados centígrados, recolecte el precipitado de nanopartículas de ambas centrificaciones.
Resuspender las nanopartículas en 300 microlitros de PBS. Cuantificar el contenido de IR783 y BC mediante cromatografía líquida de alta resolución, o HPLC, utilizando el método de elución. Calcule la eficiencia de encapsulación del profármaco, o EE por ciento, y la capacidad de carga o el porcentaje de LC.
Medir el tamaño promedio de las nanopartículas IR783 / BC con un instrumento de dispersión dinámica de luz, o DLS. Agregue 200 microlitros de solución de nanopartículas IR783 / BC en una cubeta e inserte la cubeta en el soporte para la medición. Establezca el tipo de medición como tamaño y la temperatura de medición como 25 grados centígrados.
Realice tres mediciones con una duración de 20 segundos para cada medición. Para medir la carga superficial de las nanopartículas IR783/BC con el instrumento DLS, diluya 25 microlitros de solución de nanopartículas IR783/BC con 725 microlitros de agua desionizada en un microtubo de 1,5 mililitros. Agregue la solución a una cubeta de prueba de potencial zeta.
Coloque la cubeta en la ranura de muestra. Tapa la ranura de la muestra. A continuación, establezca el tipo de medición como potencial zeta y la temperatura como 25 grados centígrados.
Realizar 10 mediciones. Una vez hecho esto, prepare las muestras para la microscopía electrónica de transmisión, o TEM, agregando 10 microlitros de solución de nanopartículas IR783 / BC en una pieza de la película de carbono agujereada en una rejilla de cobre de malla 300 y eliminando siete microlitros de la película de carbono agujereada. Deje tres microlitros de solución en la película durante la noche para la evaporación automática.
Configure una lámpara LED a 530 nanómetros con un soporte de hierro para que la luz mire directamente hacia el piso de operaciones. Coloque un fotómetro de fotodiodo de esfera integradora directamente debajo de la lámpara LED. Encienda la lámpara LED y abra la tapa del fotómetro.
Registre la irradiancia. Ajuste los parámetros de la lámpara utilizando el software asociado y ajuste la corriente de entrada en miliamperios para establecer la irradiancia como 50 milivatios por centímetro cuadrado. Diluir la solución de nanopartículas IR783/BC con agua desionizada a 50 micromolar, según la concentración de BC.
Agregue 200 micromolares IR783 / BC solución de nanopartículas en un microtubo de 1.5 mililitros. Coloque el tubo en un bloque de espuma que tenga una ranura que se ajuste al tamaño del microtubo y a la misma altura que el fotómetro. Abra la tapa del tubo.
Encienda la lámpara LED e irradie la solución de nanopartículas durante 1, 2, 3, 5, 7 y 10 minutos. Después de la irradiación de luz, cuantificar el consumo de BC y la liberación de Cb por HPLC y calcular la liberación de BC y Cb restante. Las nanopartículas IR783/BC se fabricaron con éxito en este estudio utilizando un método de precipitación flash.
Las nanopartículas sintetizadas estaban presentes como una solución púrpura, mientras que la solución acuosa de IR783 era azul. Las nanopartículas IR783/BC exhibieron un tamaño promedio de 87,22 nanómetros con un índice de polidispersidad, o PDI, de 0,089; lo que demuestra una distribución de tamaño estrecha. La carga superficial fue de aproximadamente menos 29,8 milivoltios, lo que indica los grupos sulfonato cargados negativamente de IR783.
El tamaño de las nanopartículas se mantuvo en 85 nanómetros durante al menos 48 horas después de la fabricación, mientras que su PDI permaneció inferior a 0,2. No se observaron cambios significativos en la distribución de tamaños a las 0, 24 y 48 horas después de la fabricación. Se observaron agregados y fragmentos después de una irradiación más ligera.
Se observaron cambios de tamaño y distribución después de tres y cinco minutos de irradiación de luz. Prodrug BC fue fotografiado en 10 minutos. Mientras tanto, el clorambucilo se liberó con una eficiencia de recuperación de alrededor del 22% en el mismo período.
Las nanopartículas IR783/BC mostraron citotoxicidad significativa en las células tumorales colorrectales humanas HCT 116 bajo irradiación ligera a 530 nanómetros en comparación con el grupo sin irradiación. Es importante tocar la pared interna del microtubo firmemente con el extremo de los péptidos y colocar el microtubo en el vórtice de manera estable.
