このプロトコルは、光応答性薬物色素システムの構築と特性評価、特に光放射のセットアップに関するリファレンスを提供します。この技術は、簡単な製造、高い薬物負荷容量、および光制御性の利点を示しています。この技術は、腫瘍部位での薬物放出を活性化するための光を送達するために光ファイバーの助けを借りて結腸直腸腫瘍を治療するために使用することができる。
10ミリグラムのホウ素ジピロメテンクロラムブシルまたはBCプロドラッグを計量することから始め、それを1.5ミリリットルのマイクロチューブ中の1ミリリットルのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解します。BC溶液をホイルで覆い、ろ過した脱イオン水中で1ミリリットルあたり0.4ミリグラムのIR783を調製し、300ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。このマイクロチューブを1500RPMのボルテックスミキサーに置きます。
次に、20マイクロリットルのピペットチップの端がマイクロチューブの内壁に接触した状態で、20マイクロリットルのBC溶液をIR783溶液に10秒間一定の速度で加えます。マイクロチューブをボルテックスミキサーに30秒間置き、IR783 / BCナノ粒子を取得します。次に、ナノ粒子溶液をホイルで完全に覆われたラックに置きます。
得られたIR783/BCナノ粒子溶液を2000G、摂氏4度で10分間遠心分離し、凝集体を除去します。上清を収集し、ペレットを乱さないようにチューブ内に約20マイクロリットルを残してから廃棄します。上清を30, 000Gおよび摂氏4度で30分間2回遠心分離した後、両方の遠心分離からナノ粒子沈殿物を収集する。
ナノ粒子を300マイクロリットルのPBSに再懸濁します。IR783およびBCの含有量は、溶出法を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により定量します。プロドラッグ封入効率、またはEEパーセント、および負荷容量またはLCパーセントを計算する。
動的光散乱(DLS)装置を使用してIR783/BCナノ粒子の平均サイズを測定します。200マイクロリットルのIR783/BCナノ粒子溶液をキュベットに入れ、測定のためにキュベットをホルダーに挿入します。測定タイプをサイズに設定し、測定温度を摂氏25度に設定します。
測定ごとに20秒の持続時間で3つの測定を実行します。DLS装置でIR783/BCナノ粒子の表面電荷を測定するには、25マイクロリットルのIR783/BCナノ粒子溶液を725マイクロリットルの脱イオン水で1.5ミリリットルのマイクロチューブで希釈します。溶液をゼータ電位テストキュベットに追加します。
キュベットをサンプル溝に入れます。サンプル溝にキャップをします。次に、測定タイプをゼータ電位、温度を摂氏25度に設定します。
10回の測定を実行します。完了したら、300メッシュの銅グリッド上のホールカーボン膜の一部に10マイクロリットルのIR783/BCナノ粒子溶液を加え、ホールリーカーボン膜から7マイクロリットルを除去することにより、透過型電子顕微鏡(TEM)イメージング用のサンプルを準備します。自動蒸発のために、フィルム上に3マイクロリットルの溶液を一晩放置します。
530ナノメートルのLEDランプを鉄スタンドで設置し、光が操作フロアに直接向くようにします。積分球フォトダイオード光度計をLEDランプの真下に配置します。LEDランプをオンにして、光度計のキャップを開きます。
放射照度を記録します。関連するソフトウェアを使用してランプパラメータを設定し、ミリアンペア単位で入力電流を調整して、放射照度を50ミリワット/平方センチメートルに設定します。IR783/BCナノ粒子溶液を脱イオン水でBC濃度に基づいて50マイクロモルに希釈します。
200マイクロモルのIR783/BCナノ粒子溶液を1.5ミリリットルのマイクロチューブに加えます。マイクロチューブのサイズにフィットし、光度計と同じ高さの溝を有するフォームブロック上にチューブを置きます。チューブのキャップを開けます。
LEDランプのスイッチを入れ、ナノ粒子溶液を1、2、3、5、7、10分間照射します。光照射後、HPLCによりBC消費量とCb放出量を定量し、残りのBCとCb放出量を算出する。IR783/BCナノ粒子は、フラッシュ沈殿法を用いて本研究で首尾よく作製された。
合成されたナノ粒子は紫色の溶液として存在し、IR783の水溶液は青色であった。IR783/BCナノ粒子は、平均サイズが87.22ナノメートル、多分散指数(PDI)が0.089であり、狭いサイズ分布を示しています。表面電荷は約マイナス29.8ミリボルトであり、IR783の負に帯電したスルホン酸基を示しています。
ナノ粒子サイズは、製造後少なくとも48時間85ナノメートルに維持されたが、そのPDIは0.2未満のままであった。作製後0時間、24時間、48時間でサイズ分布に大きな変化は見られなかった。凝集体および断片は、より軽い照射後に観察された。
サイズおよび分布の変化は、光照射の3分および5分後に観察された。プロドラッグBCは10分で光切断した。一方、クロラムブシルは同期間に約22%の回収効率で放出されました。
IR783/BCナノ粒子は、非照射群と比較して、530ナノメートルの光照射下でヒト結腸直腸腫瘍細胞HCT 116に対して有意な細胞毒性を示した。マイクロチューブの内壁にペプチドの端にしっかりと触れ、マイクロチューブを渦の上に安定して配置することが重要です。
