Este protocolo fornece uma referência na construção e caracterização de sistemas corantes fotorresponsivos, especialmente na configuração da radiação luminosa. Essa técnica mostra a vantagem da simplicidade de fabricação, da alta capacidade de carga de fármacos e da fotocontrolabilidade. Esta técnica pode ser usada para tratar o tumor colorretal com a ajuda de fibra óptica para fornecer luzes para ativar a liberação da droga no local do tumor.
Comece pesando 10 miligramas do dipirrometeno de boro clorambucil ou pró-fármaco BC e dissolva-o em um mililitro de dimetil sulfóxido, ou DMSO, em um microtubo de 1,5 mililitro. Cubra a solução BC com papel alumínio, prepare 0,4 miligramas por mililitro IR783 em água deionizada filtrada e transfira 300 microlitros em um microtubo de 1,5 mililitro. Coloque este micro tubo em um misturador de vórtice a 1500 RPM.
Em seguida, com a extremidade da ponta da pipeta de 20 microlitros tocando a parede interna do microtubo, adicione 20 microlitros da solução BC à solução IR783 durante 10 segundos a uma taxa constante. Coloque o microtubo no misturador de vórtices por 30 segundos para obter as nanopartículas IR783/BC. Em seguida, coloque a solução de nanopartículas em um rack totalmente coberto com papel alumínio.
Centrifugar a solução de nanopartículas IR783/BC resultante durante 10 minutos a 2000 G e quatro graus Celsius para remover agregados. Recolher o sobrenadante, deixando aproximadamente 20 microlitros no tubo para não perturbar o pellet antes de descartá-lo. Depois de centrifugar o sobrenadante duas vezes por 30 minutos a 30.000 G e 4 graus Celsius, coletar o precipitado de nanopartículas de ambas as centrificações.
Ressuspender as nanopartículas em 300 microlitros de PBS. Quantificar o conteúdo de IR783 e BC por cromatografia líquida de alta eficiência, ou HPLC, usando o método de eluição. Calcule a eficiência de encapsulamento de pró-fármacos, ou porcentagem de EE, e a capacidade de carga ou, porcentagem de LC.
Para medir o tamanho médio das nanopartículas IR783/BC com um instrumento de espalhamento dinâmico de luz, ou DLS. Adicionar 200 microlitros de solução de nanopartículas IR783/BC em uma cubeta e inserir a cubeta no suporte para medição. Defina o tipo de medição como tamanho e a temperatura de medição como 25 graus Celsius.
Realizar três medições com duração de 20 segundos para cada medida. Para medir a carga superficial das nanopartículas IR783/BC com o instrumento DLS, diluir 25 microlitros de solução de nanopartículas IR783/BC com 725 microlitros de água deionizada em um microtubo de 1,5 mililitro. Adicione a solução em uma cubeta de teste de potencial zeta.
Coloque a cubeta no sulco da amostra. Tampar o sulco da amostra. Em seguida, defina o tipo de medição como potencial zeta e a temperatura como 25 graus Celsius.
Realize 10 medições. Uma vez feito, prepare as amostras para microscopia eletrônica de transmissão, ou TEM, adicionando 10 microlitros de solução de nanopartículas IR783/BC em um pedaço do filme de carbono holey em uma grade de cobre de 300 mesh e removendo sete microlitros do filme de carbono holey. Deixe três microlitros de solução no filme durante a noite para autoevaporação.
Configure uma lâmpada LED de 530 nanômetros com um suporte de ferro para que a luz esteja diretamente voltada para o piso de operação. Coloque um fotômetro de fotodiodo de esfera integrada diretamente sob a lâmpada LED. Ligue a lâmpada LED e abra a tampa do fotômetro.
Registre a irradiância. Ajuste os parâmetros da lâmpada usando o software associado e ajuste a corrente de entrada no miliampere para definir a irradiância como 50 miliwatts por centímetro quadrado. Diluir a solução de nanopartículas IR783/BC com água deionizada para 50 micromolares, com base na concentração de BC.
Adicione 200 solução de nanopartículas micromolares IR783/BC em um microtubo de 1,5 mililitro. Coloque o tubo sobre um bloco de espuma com uma ranhura que se encaixe no tamanho do microtubo e na mesma altura que o fotômetro. Abra a tampa do tubo.
Ligue a lâmpada LED e irradie a solução de nanopartículas por 1, 2, 3, 5, 7 e 10 minutos. Após a irradiação luminosa, quantificar o consumo de BC e a liberação de Cb por HPLC e calcular a liberação restante de BC e Cb. Nanopartículas de IR783/BC foram fabricadas com sucesso neste estudo usando um método de precipitação flash.
As nanopartículas sintetizadas estavam presentes como uma solução roxa, enquanto a solução aquosa de IR783 era azul. As nanopartículas IR783/BC exibiram um tamanho médio de 87,22 nanômetros com um índice de polidispersidade, ou PDI, de 0,089;demonstrando uma distribuição de tamanho estreita. A carga superficial foi de aproximadamente menos 29,8 milivolts, indicando os grupos sulfonato negativamente carregados de IR783.
O tamanho das nanopartículas foi mantido em 85 nanômetros por pelo menos 48 horas após a fabricação, enquanto seu PDI permaneceu inferior a 0,2. Não foi observada alteração significativa na distribuição de tamanho 0, 24 e 48 horas após a fabricação. Agregados e fragmentos foram observados após irradiação mais leve.
Mudanças de tamanho e distribuição foram observadas após três e cinco minutos de irradiação luminosa. O Prodrug BC foi clivado em 10 minutos. Enquanto isso, o clorambucil foi liberado com uma eficiência de recuperação de cerca de 22% no mesmo período.
As nanopartículas IR783/BC exibiram citotoxicidade significativa em células tumorais colorretais humanas HCT 116 sob irradiação luminosa a 530 nanômetros em comparação com o grupo sem irradiação. É importante tocar a parede interna do microtubo firmemente com a extremidade dos peptídeos e colocar o microtubo no vórtice de forma estável.
