Questo protocollo fornisce un riferimento sulla costruzione e la caratterizzazione di sistemi di coloranti farmacologici fotoreattivi, in particolare la configurazione della radiazione luminosa. Questa tecnica mostra il vantaggio della fabbricazione semplice, dell'elevata capacità di carico del farmaco e della fotocontrollabilità. Questa tecnica può essere utilizzata per trattare il tumore del colon-retto con l'aiuto della fibra ottica per fornire luci per attivare il rilascio del farmaco nel sito del tumore.
Inizia pesando 10 milligrammi del dipirrometene clorambucile di boro o del profarmaco BC e scioglierlo in un millilitro di dimetilsolfossido, o DMSO, in un micro tubo da 1,5 millilitri. Coprire la soluzione BC con un foglio, quindi preparare 0,4 milligrammi per millilitro IR783 in acqua deionizzata filtrata e trasferire 300 microlitri in un micro tubo da 1,5 millilitri. Posizionare questo microtubo su un miscelatore a vortice a 1500 RPM.
Successivamente, con l'estremità della punta della pipetta da 20 microlitri che tocca la parete interna del microtubo, aggiungere 20 microlitri della soluzione BC alla soluzione IR783 in 10 secondi a velocità costante. Posizionare il microtubo sul miscelatore a vortice per 30 secondi per ottenere le nanoparticelle IR783/BC. Quindi posizionare la soluzione di nanoparticelle su un rack completamente coperto con un foglio.
Centrifugare la soluzione di nanoparticelle IR783/BC risultante per 10 minuti a 2000 G e quattro gradi Celsius per rimuovere gli aggregati. Raccogliere il surnatante, lasciando circa 20 microlitri nel tubo per evitare di disturbare il pellet prima di scartarlo. Dopo aver centrifugato il surnatante due volte per 30 minuti a 30.000 G e 4 gradi Celsius, raccogliere il precipitato di nanoparticelle da entrambe le centrificazioni.
Risospendere le nanoparticelle in 300 microlitri di PBS. Quantificare il contenuto di IR783 e BC mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, utilizzando il metodo di eluizione. Calcola l'efficienza di incapsulamento del profarmaco, o percentuale EE, e la capacità di carico o, percentuale LC.
Misurare la dimensione media delle nanoparticelle IR783/BC con uno strumento di diffusione dinamica della luce, o DLS. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di nanoparticelle IR783/BC in una cuvetta e inserire la cuvetta nel supporto per la misurazione. Impostare il tipo di misurazione come dimensione e la temperatura di misurazione su 25 gradi Celsius.
Eseguire tre misurazioni con una durata di 20 secondi per ogni misurazione. Per misurare la carica superficiale delle nanoparticelle IR783/BC con lo strumento DLS, diluire 25 microlitri di soluzione di nanoparticelle IR783/BC con 725 microlitri di acqua deionizzata in un micro tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere la soluzione in una cuvetta di prova del potenziale zeta.
Posizionare la cuvetta nella scanalatura del campione. Tappare la scanalatura del campione. Quindi, impostare il tipo di misurazione come potenziale zeta e la temperatura come 25 gradi Celsius.
Eseguire 10 misurazioni. Una volta fatto, preparare i campioni per la microscopia elettronica a trasmissione, o TEM, aggiungendo 10 microlitri di soluzione di nanoparticelle IR783 / BC su un pezzo del film di carbonio holey su una griglia di rame di 300 maglie e rimuovendo sette microlitri dal film di carbonio holey. Lasciare tre microlitri di soluzione sul film durante la notte per l'evaporazione automatica.
Installare una lampada a LED a 530 nanometri con un supporto in ferro in modo che la luce sia rivolta direttamente verso il piano operatorio. Posizionare un fotometro a fotodiodo a sfera integrato direttamente sotto la lampada a LED. Accendere la lampada a LED e aprire il cappuccio del fotometro.
Registrare l'irradianza. Impostare i parametri della lampada utilizzando il software associato e regolare la corrente di ingresso nel milliampere per impostare l'irradianza come 50 milliwatt per centimetro quadrato. Diluire la soluzione di nanoparticelle IR783/BC con acqua deionizzata a 50 micromolari, in base alla concentrazione di BC.
Aggiungere 200 micromolari IR783 / BC soluzione di nanoparticelle in un micro tubo da 1,5 millilitri. Posizionare il tubo su un blocco di schiuma avente una scanalatura adatta alle dimensioni del microtubo e alla stessa altezza del fotometro. Aprire il tappo del tubo.
Accendere la lampada a LED e irradiare la soluzione di nanoparticelle per 1, 2, 3, 5, 7 e 10 minuti. Dopo l'irradiazione luminosa, quantificare il consumo di BC e il rilascio di Cb da parte di HPLC e calcolare il rimanente rilascio di BC e Cb. Le nanoparticelle IR783/BC sono state fabbricate con successo in questo studio utilizzando un metodo di precipitazione flash.
Le nanoparticelle sintetizzate erano presenti come soluzione viola mentre la soluzione acquosa di IR783 era blu. Le nanoparticelle IR783/BC hanno mostrato una dimensione media di 87,22 nanometri con un indice di polidispersità, o PDI, di 0,089, dimostrando una distribuzione dimensionale ristretta. La carica superficiale era di circa meno 29,8 millivolt, indicando i gruppi solfonati caricati negativamente di IR783.
La dimensione delle nanoparticelle è stata mantenuta a 85 nanometri per almeno 48 ore dopo la fabbricazione, mentre il suo PDI è rimasto inferiore a 0,2. Non è stato osservato alcun cambiamento significativo nella distribuzione delle dimensioni a 0, 24 e 48 ore dopo la fabbricazione. Aggregati e frammenti sono stati osservati dopo irradiazione più leggera.
I cambiamenti di dimensioni e distribuzione sono stati osservati dopo tre e cinque minuti di irradiazione luminosa. Prodrug BC è stato scisso in foto in 10 minuti. Nel frattempo, il clorambucile è stato rilasciato con un'efficienza di recupero di circa il 22% nello stesso periodo.
Le nanoparticelle IR783/BC hanno mostrato una citotossicità significativa sulle cellule tumorali del colon-retto umano HCT 116 sotto irradiazione luminosa a 530 nanometri rispetto al gruppo non irradiante. È importante toccare saldamente la parete interna del micro tubo con l'estremità dei peptidi e posizionare stabilmente il micro tubo sul vortice.
