Этот протокол содержит справочную информацию по построению и характеристике фоточувствительных систем лекарственного средства и красителей, особенно по настройке светового излучения. Этот метод демонстрирует преимущество простого изготовления, высокой грузоподъемности лекарственного средства и возможности фотоконтроля. Этот метод может быть использован для лечения колоректальной опухоли с помощью оптического волокна для доставки света для активации высвобождения лекарства в месте опухоли.
Начните с взвешивания 10 миллиграммов дипиррометена бора хлорамбуцила или пролекарства BC и растворите его в одном миллилитре диметилсульфоксида или ДМСО в микропробирке объемом 1,5 миллилитра. Накройте раствор BC фольгой, затем приготовьте 0,4 миллиграмма на миллилитр IR783 в отфильтрованной деионизированной воде и перелейте 300 микролитров в микропробирку объемом 1,5 миллилитра. Поместите эту микротрубку на вихревой смеситель со скоростью 1500 об/мин.
Затем, когда конец наконечника пипетки объемом 20 микролитров касается внутренней стенки микротрубки, добавьте 20 микролитров раствора BC в раствор IR783 в течение 10 секунд с постоянной скоростью. Поместите микротрубку на вихревой смеситель на 30 секунд, чтобы получить наночастицы IR783 / BC. Затем поместите раствор наночастиц на решетку, полностью покрытую фольгой.
Центрифугируйте полученный раствор наночастиц IR783 / BC в течение 10 минут при 2000 G и четырех градусах Цельсия для удаления заполнителей. Соберите надосадочную жидкость, оставив примерно 20 микролитров в пробирке, чтобы не потревожить гранулу, прежде чем выбросить ее. После центрифугирования надосадочной жидкости два раза в течение 30 минут при 30 000 G и 4 градусах Цельсия соберите наночастицы осадка из обоих центрификаций.
Ресуспендирование наночастиц в 300 микролитрах PBS. Количественно определите содержание IR783 и BC с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или ВЭЖХ с использованием метода элюирования. Рассчитайте эффективность инкапсуляции пролекарства, или EE проценты, и грузоподъемность, или LC проценты.
Для измерения среднего размера наночастиц IR783/BC с помощью прибора динамического рассеяния света (DLS). Добавьте 200 микролитров раствора наночастиц IR783/BC в кювету и вставьте кювету в держатель для измерения. Установите тип измерения как размер и температуру измерения как 25 градусов по Цельсию.
Выполните три измерения продолжительностью 20 секунд для каждого измерения. Чтобы измерить поверхностный заряд наночастиц IR783/BC с помощью прибора DLS, разбавьте 25 микролитров раствора наночастиц IR783/BC 725 микролитрами деионизированной воды в микротрубке объемом 1,5 миллилитра. Добавьте раствор в кювету для тестирования дзета-потенциала.
Поместите кювету в канавку для образца. Закройте канавку для образца. Затем установите тип измерения как дзета-потенциал и температуру как 25 градусов по Цельсию.
Выполните 10 измерений. После этого подготовьте образцы для визуализации просвечивающей электронной микроскопии или ПЭМ, добавив 10 микролитров раствора наночастиц IR783 / BC на кусок дырявой углеродной пленки на медной сетке размером 300 меш и удалив семь микролитров из дырявой углеродной пленки. Оставьте три микролитра раствора на пленке на ночь для автоматического испарения.
Установите светодиодную лампу на 530 нанометров с железной подставкой так, чтобы свет был направлен прямо на операционный пол. Поместите интегрирующий сферический фотодиодный фотометр непосредственно под светодиодную лампу. Включите светодиодную лампу и откройте крышку фотометра.
Запишите освещенность. Установите параметры лампы с помощью соответствующего программного обеспечения и отрегулируйте входной ток в миллиамперах, чтобы установить освещенность как 50 милливатт на квадратный сантиметр. Разбавьте раствор наночастиц IR783/BC деионизированной водой до 50 мкмоль, исходя из концентрации BC.
Добавьте 200 микромолярных растворов наночастиц IR783 / BC в микропробирку объемом 1,5 миллилитра. Поместите трубку на пеноблок, имеющий канавку, соответствующую размеру микротрубки и на той же высоте, что и фотометр. Откройте крышку тюбика.
Включите светодиодную лампу и облучайте раствор наночастиц в течение 1, 2, 3, 5, 7 и 10 минут. После облучения светом количественно определите потребление BC и высвобождение Cb с помощью ВЭЖХ и рассчитайте оставшееся высвобождение BC и Cb. Наночастицы IR783 / BC были успешно изготовлены в этом исследовании с использованием метода мгновенного осаждения.
Синтезированные наночастицы присутствовали в виде фиолетового раствора, в то время как водный раствор IR783 был синим. Наночастицы IR783 / BC показали средний размер 87,22 нанометра с индексом полидисперсности, или PDI, 0,089, демонстрируя узкое распределение по размерам. Поверхностный заряд составлял примерно минус 29,8 милливольт, что указывает на отрицательно заряженные сульфонатные группы IR783.
Размер наночастиц поддерживался на уровне 85 нанометров в течение не менее 48 часов после изготовления, в то время как их PDI оставался менее 0,2. Никаких существенных изменений в распределении по размерам не наблюдалось через 0, 24 и 48 часов после изготовления. Агрегаты и фрагменты наблюдались после более легкого облучения.
Изменения размера и распределения наблюдались после трех и пяти минут облучения светом. Пролекарство БК было фоторасщеплено за 10 минут. Между тем, хлорамбуцил был высвобожден с эффективностью извлечения около 22% за тот же период.
Наночастицы IR783 / BC показали значительную цитотоксичность на клетках колоректальной опухоли человека HCT 116 при облучении светом на глубине 530 нанометров по сравнению с группой без облучения. Важно плотно прикоснуться к внутренней стенке микротрубки концом пептидов и стабильно разместить микротрубку на вихре.
