פרוטוקול זה מדגים כיצד לגדל ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ומראה כיצד ניתן לבצע ניסויים פרוטאומיים כדי לאפיין את הפונקציה הביולוגית של מבנים תלת-ממדיים. התרבית התלת-ממדית שלנו יכולה לייצר בו זמנית מאות עותקים ביולוגיים משוכפלים באותו ביוריאקטור, וגישת LC-MS יכולה למדוד את השפע של אלפי חלבונים בניסוי יחיד. מי שתדגים את ההליך תהיה סטפני סטרנסקי, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה.
כדי להתחיל, קח את התרחיף של תאי HepG2/C3A ו- THLE-3. ספרו את מספר התאים ודללו את תרחיף התא במצע גדילה מלא כדי להשיג מיליון תאים בנפח מרבי של 1.5 מיליליטר. לשטוף את הבארות של מצורף נמוך במיוחד, צלחת תחתונה עגולה 24 היטב עם 0.5 מיליליטר של מדיה צמיחה צנטריפוגה ב 3, 000 גרם במשך חמש דקות.
מעבירים את מתלה התא לצלחת וצנטריפוגות אותו למשך שלוש דקות במשקל 120 גרם. לאחר מכן, לדגור על הצלחת כדי ליזום היווצרות ספרואידים. לאחר מכן, אזנו את הביוריאקטור 24 שעות לפני העברת הספרואידים על ידי מילוי תא הלחות ב -25 מיליליטר מים סטריליים ואת תא התא בתשעה מיליליטר של מצע גידול באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט ארוכה.
לאחר מכן, הניחו את הביוריאקטור באינקובטור תלת ממדי למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. מקציפים בעדינות את הספרואידים מעלה ומטה באמצעות קצוות ברוחב מיליליטר אחד כדי לנתק אותם מצלחת החיבור הנמוכה במיוחד ולהעביר אותם לצלחת תרבית רקמות. כדי ללכוד את כל הספרואידים שנותרו, שטפו את הצלחת עם 0.5 מיליליטר של מצע צמיחה שחומם מראש והעבירו אותם לצלחת התרבית.
באמצעות מיקרוסקופ אור, להעריך את הגודל, קומפקטיות, מעוגלות של spheroids כדי לבחור את אלה שנוצרו כראוי. העבירו את הספרואיד שנבחר לביוריאקטור המאזן המלא בחמישה מיליליטר של מצע גידול טרי. לאחר מכן, מלאו את כל הביוריאקטור במצע גידול טרי.
מקם את הביוריאקטור באינקובטור התלת-ממדי והתאם את מהירות הסיבוב באמצעות יחידת הבקרה. החלף 10 מיליליטר של מצע צמיחה ישן עם 10 מיליליטר של מדיה טרייה כל יומיים-שלושה. שנה את מהירות הסיבוב בכל פעם לאחר החלפת המדיה.
תרביתו את הספרואידים במשך 15 יום וחלקו אותם בין שני ביוריאקטורים טריים. פתח את אפליקציית התלת-ממד המותקנת בטאבלט, בחר את הביוריאקטור וצלם את התמונה. כחלופה, מקמו רקע שחור מאחורי הביוריאקטור וודאו שלא מוחזר אור על תא התא.
צלם את התמונה קרוב ככל האפשר לביוריאקטור. לאחר מכן, אספו ספרואידים על ידי הסרת חמישה מיליליטר של מדיה מהביוריאקטור באמצעות מזרק המחובר למחט ארוכה דרך היציאה העליונה. ודא שהספרואידים יורדים למרכז התחתון של הביוריאקטור.
כעת, פתחו את היציאה הקדמית ואספו את הספרואידים באמצעות קצה נשא ברוחב מיליליטר. מעבירים את הספרואידים האלה לצינורות מיקרו צנטריפוגות, צנטריפוגות במשקל 500 גרם למשך חמש דקות, ומשליכים את המדיה. לשטוף את הספרואיד על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של HBSS כדי להסיר את FBS.
לאחר מכן, לבצע צנטריפוגה ב 500g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. לאחר מכן, טבלו את כדורית הספרואיד במהירות בחנקן נוזלי כדי להקפיא אותה ואחסנו את הגלולה הקפואה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. כדי ליזה את התאים, לקחת צינור של spheroids שנאספו ולהשעות אותם מחדש ב 25 מיקרוליטר של 5% SDS.
הומוגניזציה של הגלולה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, להמיס מיקרוגרם אחד של דגימות ו 10 מיקרוליטר של 0.1% חומצה trichloroacetic. לאחר מיצוי החלבון וניקוי הדגימות, הגדר את שיטת רכישת הטרשת הנפוצה כדי ליצור את ספקטרום MS/MS מהאותות הפפטידים שזוהו.
לאחר מכן, להעביר את הצלחת לתוך autosampler כרומטוגרפיה נוזלית ננוליטר. הגדר את סריקת MS המלאה ליחס מסה לטעינה של 300 ל- 1, 100 ב- Orbitrap. התאם את הרזולוציה ל- 120000 והגדר את יעד בקרת ההגבר האוטומטי ל- 125.
לאחר מכן, הגדר MS/MS באורביטרפ עם חלון בידוד רציף של יחס מסה למטען של 50. כוונו את יעד בקרת ההגברה האוטומטית ל-400 והגדירו אנרגיית דיסוציאציה התנגשות אנרגטית גבוהה יותר של 30. על פי ניתוח כדאיות של ספרואידים, רמות אדנילט קינאז עולות עד היום ה -17, וכתוצאה מכך כ -7% מהמוות התאים.
לאחר מכן, שיעור התמותה יורד אל מתחת ל-5% יתר על כן, ניתוח של המרכיב העיקרי הראשון מגלה הבחנה ברורה בין דגימות ספרואידים לבין תרביות תאים שטוחים. הניתוח הפרוטאומי הצביע על כך שלספרואידים THLE-3 ו- HepG2/C3A יש פרופילים דומים המשקפים את תפקוד הכבד. בנוסף, הספרואידים הראו ביטוי יתר של שני איזופורמים של מטלותיונינים בהשוואה לתאים שטוחים.
רשתות מקובצות פונקציונלית הראו העשרה אונטולוגית גנטית לתהליך חילוף החומרים של פחמימות בכדורי HepG2/C3A ו-THLE-3. כדי למנוע שפיכת מצעי גדילה, אין לפתוח או לסגור את היציאה הקדמית כאשר תא התא מלא במלואו בנוזל. הכנת הדגימה וניתוחה המתוארים בפרוטוקול זה יכולים לשמש לחקר הפרוטאום של תרבית תאים בשיטות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, כמו גם דגימות רקמות.
