このプロトコルは、再現性の高いスフェロイドを育てる方法を示し、プロテオミクス実験が3D構造の生物学的機能を特徴付けるためにどのように実施できるかを示しています。当社の 3D 培養では、同じバイオリアクターで数百の生物学的複製を同時に生成でき、LC-MS アプローチでは、1 回の実験で数千のタンパク質の存在量を測定できます。この手順を実演するのは、研究室のポスドクであるStephanie Stransky氏です。
まず、HepG2 / C3AおよびTHLE-3細胞の懸濁液を取ります。細胞数を数え、細胞懸濁液を完全増殖培地で希釈して、最大容量1.5ミリリットルで100万個の細胞を得ます。0.5ミリリットルの成長培地で超低アタッチメントの24ウェル丸底板のウェルを洗浄し、3, 000gで5分間遠心分離します。
細胞懸濁液をプレートに移し、120gで3分間遠心分離します。次に、プレートをインキュベートしてスフェロイド形成を開始します。次に、長い針が付いた10ミリリットルのシリンジを使用して、湿度チャンバーに25ミリリットルの滅菌水を、細胞チャンバーに9ミリリットルの成長培地を充填することにより、スフェロイドを移送する24時間前にバイオリアクターを平衡化します。
次に、バイオリアクターを3Dインキュベーターに摂氏37度で24時間、5%の二酸化炭素を入れます。1ミリリットル幅のボアチップを使用してスフェロイドを静かに上下にピペットで移動し、超低アタッチメントプレートからスフェロイドを取り外し、組織培養皿に移します。残っているスフェロイドを捕捉するには、0.5ミリリットルの予熱した増殖培地でプレートを洗浄し、培養皿に移します。
光学顕微鏡を使用して、スフェロイドのサイズ、コンパクトさ、真円度を評価し、適切に形成されたスフェロイドを選択します。選択したスフェロイドを、5ミリリットルの新鮮な増殖培地で満たされた平衡化バイオリアクターに移します。次に、バイオリアクター全体を新鮮な増殖培地で満たします。
バイオリアクターを3Dインキュベーターに配置し、コントロールユニットを使用して回転速度を調整します。2〜3日ごとに10ミリリットルの古い培地を10ミリリットルの新鮮な培地と交換します。メディア交換後は毎回回転数を変えてください。
スフェロイドを 15 日間培養し、2 つの新鮮なバイオリアクターに分割します。タブレットにインストールされている3Dアプリを開き、バイオリアクターを選択して画像をキャプチャします。別の方法として、バイオリアクターの後ろに黒い背景を配置し、細胞室で光が反射しないようにします。
できるだけバイオリアクターの近くで画像を撮影します。次に、上部ポートから長い針に取り付けられたシリンジを使用して、バイオリアクターから5ミリリットルの培地を取り除き、スフェロイドを回収します。スフェロイドがバイオリアクターの下部中央に下降していることを確認します。
次に、フロントポートを開き、1ミリリットル幅のボアチップを使用してスフェロイドを収集します。これらのスフェロイドをマイクロ遠心チューブに移し、500gで5分間遠心分離し、培地を廃棄します。FBSを除去するために、200マイクロリットルのHBSSを加えてスフェロイドを洗浄します。
この後、500gで5分間遠心分離を行い、上清を廃棄する。次に、回転楕円体ペレットを液体窒素に急速に浸漬して凍結し、この凍結ペレットをマイナス80°Cでさらに処理するまで保存します。細胞を溶解するには、採取したスフェロイドのチューブを取り、25マイクロリットルの5%SDSに再懸濁します。
ピペッティングで上下させてペレットを均質化します。次に、1マイクログラムのサンプルと10マイクロリットルの0.1%トリクロロ酢酸を溶解します。タンパク質を抽出し、サンプルを洗浄した後、同定されたペプチドシグナルからMS/MSスペクトルを生成するようにMS取り込みメソッドを設定します。
次に、プレートをナノリットル液体クロマトグラフィーオートサンプラーに移します。Orbitrap でフル MS スキャンを 300 対 1, 100 の質量電荷比に設定します。解像度を 120000 に調整し、自動ゲイン制御ターゲットを 125 に設定します。
次に、質量電荷比 50 のシーケンシャル分離ウィンドウで Orbitrap の MS/MS を設定します。自動ゲイン制御の目標を 400 に向け、より高いエネルギーの衝突解離エネルギーを 30 に設定します。スフェロイドの生存率分析によると、アデニル酸キナーゼのレベルは17日目まで増加し、細胞死の約7%をもたらします。
その後、死亡率は5%未満に減少し、さらに、第1主成分の分析により、スフェロイドサンプルと平坦な細胞培養の明確な区別が明らかになります。プロテオミクス解析により、THLE-3スフェロイドとHepG2/C3Aスフェロイドは、肝機能を反映する類似したプロファイルを持つことが示されました。さらに、スフェロイドは、平坦な細胞と比較して、メタロチオネインの2つのアイソフォームの過剰発現を示しました。
機能的にグループ化されたネットワークは、HepG2/C3AおよびTHLE-3スフィアにおける炭水化物代謝プロセスの遺伝子オントロジー濃縮を示しました。増殖培地のこぼれを防ぐため、細胞室が液体で完全に満たされているときは、フロントポートを開閉しないでください。このプロトコルで記述されているサンプル準備および分析がティッシュのサンプルと同様、第2および3D方法を使用して細胞培養のプロテオームを探検するのに使用することができる。
