Ce protocole montre comment cultiver des sphéroïdes hautement reproductibles et montre comment des expériences protéomiques peuvent être menées pour caractériser la fonction biologique des structures 3D. Notre culture 3D peut produire simultanément des centaines de répétitions biologiques dans le même bioréacteur, et l’approche LC-MS peut mesurer l’abondance de milliers de protéines en une seule expérience. Stephanie Stransky, une postdoctorante du laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Pour commencer, prenez la suspension des cellules HepG2/C3A et THLE-3. Comptez le nombre de cellules et diluez la suspension cellulaire dans un milieu de croissance complet pour obtenir 1 million de cellules dans un volume maximum de 1,5 millilitre. Lavez les puits d’une plaque inférieure ronde à 24 puits à très faible adhérence avec 0,5 millilitre de milieu de culture et centrifugez à 3 000 g pendant cinq minutes.
Transférez la suspension cellulaire sur la plaque et centrifugez-la pendant trois minutes à 120 g. Ensuite, incubez la plaque pour initier la formation de sphéroïdes. Ensuite, équilibrez le bioréacteur 24 heures avant de transférer les sphéroïdes en remplissant la chambre d’humidité avec 25 millilitres d’eau stérile et la chambre cellulaire avec neuf millilitres de milieu de culture à l’aide d’une seringue de 10 millilitres avec une longue aiguille.
Ensuite, placez le bioréacteur dans un incubateur 3D pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Pipetez doucement les sphéroïdes de haut en bas à l’aide d’embouts d’alésage d’un millilitre de large pour les détacher de la plaque de fixation ultra-basse et les transférer dans une boîte de culture tissulaire. Pour capturer les sphéroïdes restants, lavez la plaque avec 0,5 millilitre de milieu de culture préchauffé et transférez-les dans la boîte de culture.
À l’aide d’un microscope optique, évaluez la taille, la compacité et la rondeur des sphéroïdes pour sélectionner ceux qui sont correctement formés. Transférez le sphéroïde sélectionné dans le bioréacteur d’équilibre rempli de cinq millilitres de milieu de culture frais. Ensuite, remplissez l’ensemble du bioréacteur avec un nouveau milieu de culture.
Positionnez le bioréacteur dans l’incubateur 3D et ajustez la vitesse de rotation à l’aide de l’unité de commande. Remplacez 10 millilitres de substrat ancien par 10 millilitres de substrat frais tous les deux à trois jours. Modifiez la vitesse de rotation à chaque fois après avoir remplacé le support.
Cultivez les sphéroïdes pendant 15 jours et répartissez-les entre deux bioréacteurs frais. Ouvrez l’application 3D installée sur la tablette, sélectionnez le bioréacteur et capturez l’image. Comme alternative, placez un fond noir derrière le bioréacteur et assurez-vous qu’aucune lumière n’est réfléchie sur la chambre cellulaire.
Capturez l’image aussi près que possible du bioréacteur. Ensuite, collectez les sphéroïdes en retirant cinq millilitres de milieu du bioréacteur à l’aide d’une seringue attachée à une longue aiguille par l’orifice supérieur. Assurez-vous que les sphéroïdes descendent vers le centre inférieur du bioréacteur.
Maintenant, ouvrez l’orifice avant et collectez les sphéroïdes à l’aide d’une pointe d’alésage large d’un millilitre. Transférez ces sphéroïdes dans des microtubes à centrifuger, centrifugez à 500 g pendant cinq minutes et jetez le milieu. Lavez le sphéroïde en ajoutant 200 microlitres de HBSS pour éliminer le FBS.
Après cela, effectuez une centrifugation à 500 g pendant cinq minutes et jetez le surnageant. Ensuite, plongez rapidement la pastille sphéroïde dans de l’azote liquide pour la congeler et stockez cette pastille congelée à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit traitée. Pour lyser les cellules, prenez un tube de sphéroïdes collectés et remettez-les en suspension dans 25 microlitres de SDS à 5%.
Homogénéiser la pastille en pipetant de haut en bas. Ensuite, dissoudre un microgramme d’échantillons et 10 microlitres d’acide trichloracétique à 0,1 %. Après avoir extrait la protéine et nettoyé les échantillons, mettez en place la méthode d’acquisition MS pour générer les spectres MS/MS à partir des signaux peptidiques identifiés.
Ensuite, transférez la plaque dans l’échantillonneur automatique de chromatographie liquide nanolitre. Réglez le balayage MS complet sur un rapport masse/charge de 300 à 1,100 dans l’Orbitrap. Ajustez la résolution à 120000 et réglez la cible de contrôle automatique du gain sur 125.
Ensuite, réglez MS/MS dans l’Orbitrap avec une fenêtre d’isolement séquentielle de 50 rapport masse/charge. Visez la cible de contrôle automatique du gain à 400 et définissez une énergie de dissociation collisionnelle d’énergie plus élevée de 30. Selon l’analyse de viabilité des sphéroïdes, les niveaux d’adénylate kinase augmentent jusqu’au jour 17, entraînant environ 7 % de la mort cellulaire.
Par la suite, le taux de mortalité diminue à moins de 5%De plus, une analyse du premier composant principal révèle une distinction claire entre les échantillons sphéroïdes et les cultures de cellules plates. L’analyse protéomique a indiqué que les sphéroïdes THLE-3 et HepG2/C3A ont des profils similaires qui reflètent la fonction hépatique. De plus, les sphéroïdes ont montré une surexpression de deux isoformes de métallothionéines par rapport aux cellules plates.
Des réseaux fonctionnellement groupés ont montré un enrichissement en ontologie des gènes pour le processus métabolique des glucides dans les sphères HepG2/C3A et THLE-3. Pour éviter le déversement du milieu de culture, n’ouvrez pas et ne fermez pas l’orifice avant lorsque la chambre cellulaire est complètement remplie de liquide. La préparation et l’analyse des échantillons décrites dans ce protocole peuvent être utilisées pour explorer le protéome de la culture cellulaire à l’aide de méthodes 2D et 3D, ainsi que des échantillons de tissus.
