功能性 3D 球状体细胞培养物的半自动表型分析

该协议演示了如何生长高度可重复的球状体，并展示了如何进行蛋白质组学实验以表征3D结构的生物学功能。我们的 3D 培养物可以在同一生物反应器中同时产生数百个生物重复，而 LC-MS 方法可以在单个实验中测量数千种蛋白质的丰度。演示该程序的是来自实验室的博士后斯蒂芬妮·斯特兰斯基（Stephanie Stransky）。

首先，服用HepG2 / C3A和THLE-3细胞的悬浮液。计数细胞数量并在完全生长培养基中稀释细胞悬液，以获得最大体积为1.5毫升的100万个细胞。用0.5毫升生长培养基洗涤超低附着点24孔圆底板的孔，并以3， 000g离心5分钟。

将细胞悬液转移到平板上，并以 120g 离心 3 分钟。然后，孵育板以启动球状体形成。接下来，在转移球体之前 24 小时平衡生物反应器，方法是使用带有长针的 10 毫升注射器向湿度室中填充 25 毫升无菌水，用 9 毫升生长培养基填充细胞室。

然后，将生物反应器放入 37 摄氏度的 3D 培养箱中 24 小时，加入 5% 二氧化碳。使用一毫升宽孔吸头轻轻地上下移液球体，将它们从超低连接板上拆下，然后转移到组织培养皿中。为了捕获任何剩余的球状体，用0.5毫升预热的生长培养基洗涤板并将它们转移到培养皿中。

使用光学显微镜，评估球体的大小、致密度和圆度，以选择充分形成的球体。将选定的球状体转移到装有 5 毫升新鲜生长培养基的平衡生物反应器中。然后，用新鲜的生长培养基填充整个生物反应器。

将生物反应器放置在 3D 培养箱中，并使用控制单元调整转速。每两到三天用 10 毫升新鲜培养基替换 10 毫升旧的生长培养基。每次更换介质后更改转速。

将球状体培养 15 天，并将它们分装在两个新鲜的生物反应器中。打开安装在平板电脑上的 3D 应用程序，选择生物反应器，然后捕获图像。作为替代方案，在生物反应器后面放置黑色背景，并确保没有光线反射到细胞室上。

尽可能靠近生物反应器捕获图像。然后，通过使用连接到长针的注射器通过顶部端口从生物反应器中取出五毫升培养基来收集球状体。确保球体下降到生物反应器的底部中心。

现在，打开前端口并使用一毫升宽的孔尖端收集球体。将这些球体转移到微量离心管中，以 500g 离心 5 分钟，然后处理培养基。通过加入 200 微升 HBSS 以除去 FBS 来洗涤球状体。

之后，以500g离心5分钟，弃去上清液。然后，将球状颗粒快速浸入液氮中冷冻，并将冷冻颗粒储存在零下 80 摄氏度直至进一步加工。为了裂解细胞，取一管收集的球状体并将它们重悬于25微升的5%SDS中。

通过上下移液使沉淀均质化。接下来，溶解 1 微克样品和 10 微升 0.1% 三氯乙酸。提取蛋白质并清洁样品后，设置MS采集方法，从鉴定的肽信号中生成MS/MS谱图。

然后，将板转移到纳升液相色谱自动进样器中。在 Orbitrap 中将完整的 MS 扫描设置为 300 比 1， 100 质荷比。将分辨率调整为120000，并将自动增益控制目标设置为125。

然后，在 Orbitrap 中设置 MS/MS，顺序隔离窗口为 50 质荷比。将自动增益控制目标瞄准 400，并将更高的能量碰撞解离能量设置为 30。根据球状体的活力分析，腺苷酸激酶的水平升高至第17天，导致约7%的细胞死亡。

之后，死亡率降至 5% 以下此外，对第一主成分的分析揭示了球状体样品和平坦细胞培养物之间的明显区别。蛋白质组学分析表明，THLE-3 和 HepG2/C3A 球状体具有反映肝功能的相似特征。此外，与扁平细胞相比，球状体显示出两种金属硫蛋白亚型的过表达。

功能分组网络显示 HepG2/C3A 和 THLE-3 球体中碳水化合物代谢过程的基因本体富集。为避免生长培养基溢出，当细胞室充满液体时，请勿打开或关闭前端口。该协议中描述的样品制备和分析可用于使用2D和3D方法探索细胞培养物的蛋白质组以及组织样品。