Dieses Protokoll zeigt, wie hochreproduzierbare Sphäroide gezüchtet werden können und wie proteomische Experimente durchgeführt werden können, um die biologische Funktion von 3D-Strukturen zu charakterisieren. Unsere 3D-Kultur kann gleichzeitig Hunderte von biologischen Replikaten im selben Bioreaktor herstellen, und der LC-MS-Ansatz kann die Häufigkeit von Tausenden von Proteinen in einem einzigen Experiment messen. Das Verfahren wird von Stephanie Stransky, einer Postdoktorandin aus dem Labor, demonstriert.
Nehmen Sie zunächst die Suspension von HepG2/C3A- und THLE-3-Zellen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension in kompletten Wachstumsmedien, um 1 Million Zellen in einem maximalen Volumen von 1,5 Millilitern zu erhalten. Waschen Sie die Vertiefungen einer runden 24-Well-Bodenplatte mit extrem niedrigem Aufsatz mit 0,5 Millilitern Wachstumsmedium und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 3.000 g.
Die Zellsuspension auf die Platte geben und drei Minuten bei 120 g zentrifugieren. Inkubieren Sie dann die Platte, um die Bildung von Sphäroiden zu initiieren. Als nächstes wird der Bioreaktor 24 Stunden vor dem Transfer der Sphäroide ins Gleichgewicht gebracht, indem die Feuchtigkeitskammer mit einer 10-Milliliter-Spritze mit einer langen Nadel mit 25 Millilitern sterilem Wasser und die Zellkammer mit neun Millilitern Wachstumsmedium gefüllt wird.
Anschließend wird der Bioreaktor für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in einen 3D-Inkubator gestellt. Pipettieren Sie die Sphäroide vorsichtig mit Spitzen mit einer Breite von einem Milliliter auf und ab, um sie von der Platte mit extrem niedrigem Aufsatz zu lösen, und übertragen Sie sie in eine Gewebekulturschale. Um verbleibende Sphäroide aufzufangen, waschen Sie die Platte mit 0,5 Millilitern vorgewärmtem Nährmedium und geben Sie sie in die Kulturschale.
Beurteilen Sie mit einem Lichtmikroskop die Größe, Kompaktheit und Rundheit der Sphäroide, um diejenigen auszuwählen, die angemessen geformt sind. Das ausgewählte Sphäroid wird in den mit fünf Millilitern frischem Wachstumsmedium gefüllten Äquilibrierbioreaktor überführt. Füllen Sie dann den gesamten Bioreaktor mit frischem Nährmedium.
Positionieren Sie den Bioreaktor im 3D-Inkubator und stellen Sie die Drehzahl über die Steuereinheit ein. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage 10 Milliliter altes Nährmedium durch 10 Milliliter frisches Medium. Ändern Sie die Rotationsgeschwindigkeit jedes Mal, nachdem Sie das Medium ausgetauscht haben.
Die Sphäroide werden 15 Tage lang kultiviert und auf zwei frische Bioreaktoren verteilt. Öffnen Sie die auf dem Tablet installierte 3D-App, wählen Sie den Bioreaktor aus und nehmen Sie das Bild auf. Alternativ können Sie einen schwarzen Hintergrund hinter dem Bioreaktor platzieren und sicherstellen, dass kein Licht auf der Zellkammer reflektiert wird.
Nehmen Sie das Bild so nah wie möglich am Bioreaktor auf. Sammeln Sie dann Sphäroide, indem Sie fünf Milliliter Medien aus dem Bioreaktor entfernen, indem Sie eine Spritze verwenden, die an einer langen Nadel durch den oberen Anschluss befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Sphäroide in die untere Mitte des Bioreaktors absinken.
Öffnen Sie nun den vorderen Anschluss und sammeln Sie die Sphäroide mit einer Spitze mit einer Breite von einem Milliliter. Füllen Sie diese Sphäroide in Mikrozentrifugenröhrchen um, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 500 g und entsorgen Sie das Medium. Waschen Sie das Sphäroid, indem Sie 200 Mikroliter HBSS hinzufügen, um das FBS zu entfernen.
Danach führen Sie eine Zentrifugation bei 500 g für fünf Minuten durch und entsorgen den Überstand. Tauchen Sie das Kugelpellet dann schnell in flüssigen Stickstoff, um es einzufrieren, und lagern Sie dieses gefrorene Pellet bis zur Weiterverarbeitung bei minus 80 Grad Celsius. Um die Zellen zu lysieren, nehmen Sie ein Röhrchen mit gesammelten Sphäroiden und resuspendieren Sie sie in 25 Mikrolitern 5%SDS.
Homogenisieren Sie das Pellet, indem Sie es auf und ab pipettieren. Anschließend werden ein Mikrogramm Proben und 10 Mikroliter 0,1%ige Trichloressigsäure aufgelöst. Nach der Extraktion des Proteins und der Reinigung der Proben richten Sie die MS-Akquisitionsmethode ein, um die MS/MS-Spektren aus den identifizierten Peptidsignalen zu erzeugen.
Übertragen Sie dann die Platte in den Nanoliter-Flüssigkeitschromatographie-Autosampler. Stellen Sie den vollständigen MS-Scan auf 300 zu 1, 100 Masse-zu-Ladungs-Verhältnis im Orbitrap ein. Stellen Sie die Auflösung auf 120000 ein und stellen Sie das Ziel für die automatische Verstärkungsregelung auf 125 ein.
Stellen Sie dann MS/MS im Orbitrap mit einem sequentiellen Isolationsfenster von 50 Masse-zu-Ladungs-Verhältnis ein. Richten Sie das Ziel für die automatische Verstärkungsregelung auf 400 aus und stellen Sie eine höhere Kollisionsdissoziationsenergie von 30 ein. Laut der Viabilitätsanalyse von Sphäroiden steigt der Adenylatkinasespiegel bis zum 17. Tag an, was zu etwa 7 % des Zelltods führt.
Danach sinkt die Sterberate auf unter 5%Darüber hinaus zeigt eine Analyse der ersten Hauptkomponente eine klare Unterscheidung zwischen Sphäroidproben und flachen Zellkulturen. Die proteomische Analyse zeigte, dass THLE-3- und HepG2/C3A-Sphäroide ähnliche Profile aufweisen, die die Leberfunktion widerspiegeln. Darüber hinaus zeigten die Sphäroide eine Überexpression von zwei Isoformen von Metallothioneinen im Vergleich zu flachen Zellen.
Funktionell gruppierte Netzwerke zeigten eine genontologische Anreicherung für den Kohlenhydratstoffwechselprozess in HepG2/C3A- und THLE-3-Sphären. Um ein Verschütten von Wachstumsmedien zu vermeiden, öffnen oder schließen Sie den vorderen Anschluss nicht, wenn die Zellkammer vollständig mit Flüssigkeit gefüllt ist. Die in diesem Protokoll beschriebene Probenvorbereitung und -analyse kann verwendet werden, um das Proteom von Zellkulturen mit 2D- und 3D-Methoden sowie von Gewebeproben zu untersuchen.
