يوضح هذا البروتوكول كيفية زراعة كرويات قابلة للتكرار بدرجة عالية ويوضح كيف يمكن إجراء تجارب بروتينية لتوصيف الوظيفة البيولوجية لهياكل 3D. يمكن لثقافة 3D الخاصة بنا أن تنتج في وقت واحد مئات النسخ البيولوجية في نفس المفاعل الحيوي ، ويمكن لنهج LC-MS قياس وفرة الآلاف من البروتينات في تجربة واحدة. ستوضح العملية ستيفاني سترانسكي ، باحثة ما بعد الدكتوراه من المختبر.
للبدء ، خذ تعليق خلايا HepG2 / C3A و THLE-3. احسب عدد الخلايا وخفف تعليق الخلية في وسائط نمو كاملة للحصول على مليون خلية بحد أقصى 1.5 ملليلتر. اغسل آبار ملحق منخفض للغاية ، صفيحة سفلية مستديرة ذات 24 بئرا مع 0.5 ملليلتر من وسائط النمو وأجهزة الطرد المركزي عند 3000 جرام لمدة خمس دقائق.
نقل تعليق الخلية إلى لوحة والطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق في 120g. ثم احتضان اللوحة لبدء تكوين كروي. بعد ذلك ، قم بموازنة المفاعل الحيوي قبل 24 ساعة من نقل الأجسام الكروية عن طريق ملء غرفة الرطوبة ب 25 ملليلتر من الماء المعقم وغرفة الخلية بتسعة ملليلتر من وسائط النمو باستخدام حقنة 10 ملليلتر بإبرة طويلة.
ثم ضع المفاعل الحيوي في حاضنة ثلاثية الأبعاد لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بسحب الأجسام الكروية برفق لأعلى ولأسفل باستخدام أطراف تجويف عريضة بحجم ملليلتر واحد لفصلها عن لوحة التثبيت المنخفضة للغاية ونقلها إلى طبق زراعة الأنسجة. لالتقاط أي كرويات متبقية ، اغسل الطبق ب 0.5 مل من وسائط النمو الدافئة مسبقا وانقلها إلى طبق الثقافة.
باستخدام المجهر الضوئي ، قم بتقييم حجم الكرويات وانضغاطها واستدارتها لاختيار تلك التي تم تشكيلها بشكل مناسب. انقل الكروي المحدد إلى المفاعل الحيوي المتوازن المملوء بخمسة ملليلتر من وسائط النمو الطازجة. ثم املأ المفاعل الحيوي بأكمله بوسائط نمو جديدة.
ضع المفاعل الحيوي في حاضنة 3D واضبط سرعة الدوران باستخدام وحدة التحكم. استبدل 10 ملليلتر من وسائط النمو القديمة ب 10 ملليلتر من الوسائط الطازجة كل يومين إلى ثلاثة أيام. قم بتغيير سرعة الدوران في كل مرة بعد استبدال الوسائط.
استزرع الكرويات لمدة 15 يوما وقسمها بين مفاعلين حيويين جديدين. افتح تطبيق 3D المثبت على الجهاز اللوحي ، وحدد المفاعل الحيوي ، والتقط الصورة. كبديل ، ضع خلفية سوداء خلف المفاعل الحيوي وتأكد من عدم انعكاس الضوء على حجرة الخلية.
التقط الصورة بالقرب من المفاعل الحيوي قدر الإمكان. بعد ذلك ، اجمع الأجسام الكروية عن طريق إزالة خمسة ملليلتر من الوسائط من المفاعل الحيوي باستخدام حقنة متصلة بإبرة طويلة عبر المنفذ العلوي. تأكد من نزول الأجسام الكروية إلى المركز السفلي للمفاعل الحيوي.
الآن ، افتح المنفذ الأمامي واجمع الكرويات باستخدام طرف تجويف عريض بحجم ملليلتر واحد. نقل هذه المواد الكروية إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة ، وأجهزة الطرد المركزي في 500g لمدة خمس دقائق ، والتخلص من وسائل الإعلام. اغسل الكرة بإضافة 200 ميكرولتر من HBSS لإزالة FBS.
بعد ذلك ، قم بإجراء الطرد المركزي عند 500 جرام لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. بعد ذلك ، اغمر الحبيبات الكروية بسرعة في النيتروجين السائل لتجميدها وتخزين هذه الحبيبات المجمدة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى مزيد من المعالجة. لتحليل الخلايا ، خذ أنبوبا من الكرويات المجمعة وأعد تعليقها في 25 ميكرولتر من 5٪ SDS.
تجانس الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، قم بإذابة ميكروغرام واحد من العينات و 10 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 0.1٪. بعد استخراج البروتين وتنظيف العينات ، قم بإعداد طريقة اكتساب MS لتوليد أطياف MS / MS من إشارات الببتيد المحددة.
بعد ذلك ، انقل اللوحة إلى جهاز أخذ العينات التلقائي للكروماتوغرافيا السائلة النانولترية. اضبط فحص MS الكامل على 300 إلى 1،100 نسبة الكتلة إلى الشحن في Orbitrap. اضبط الدقة على 120000 واضبط هدف التحكم التلقائي في الكسب على 125.
بعد ذلك ، قم بتعيين MS / MS في Orbitrap مع نافذة عزل متسلسلة تبلغ 50 نسبة كتلة إلى شحنة. صوب هدف التحكم التلقائي في الكسب عند 400 وقم بتعيين طاقة تفكك تصادم أعلى للطاقة تبلغ 30. وفقا لتحليل جدوى الكائنات الكروية ، تزداد مستويات أدينيلات كيناز حتى اليوم 17 ، مما يؤدي إلى حوالي 7٪ من موت الخلايا.
بعد ذلك ، ينخفض معدل الوفيات إلى أقل من 5٪ علاوة على ذلك ، يكشف تحليل المكون الرئيسي الأول عن تمييز واضح بين العينات الكروية ومزارع الخلايا المسطحة. أشار التحليل البروتيني إلى أن الأجسام الكروية THLE-3 و HepG2 / C3A لها ملامح متشابهة تعكس وظائف الكبد. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الكائنات الكروية تعبيرا مفرطا عن شكلين متساويين من الميتالوثيونين مقارنة بالخلايا المسطحة.
أظهرت الشبكات المجمعة وظيفيا إثراء أنطولوجيا الجينات لعملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات في مجالات HepG2 / C3A و THLE-3. لتجنب انسكاب وسائط النمو ، لا تفتح أو تغلق المنفذ الأمامي عندما تمتلئ حجرة الخلية بالكامل بالسائل. يمكن استخدام تحضير العينات وتحليلها الموصوف في هذا البروتوكول لاستكشاف بروتين زراعة الخلايا باستخدام طرق 2D و 3D ، بالإضافة إلى عينات الأنسجة.
