Este protocolo demonstra como cultivar esferoides altamente reprodutíveis e mostra como experimentos proteômicos podem ser conduzidos para caracterizar a função biológica de estruturas 3D. Nossa cultura 3D pode produzir simultaneamente centenas de réplicas biológicas no mesmo biorreator, e a abordagem LC-MS pode medir a abundância de milhares de proteínas em um único experimento. Quem demonstrará o procedimento será Stephanie Stransky, pós-doutora do laboratório.
Para começar, tome a suspensão de células HepG2/C3A e THLE-3. Contar o número de células e diluir a suspensão celular em meio de crescimento completo para obter 1 milhão de células em um volume máximo de 1,5 mililitros. Lave os poços de um acessório ultrabaixo, placa de fundo redondo de 24 poços com 0,5 mililitros de meio de crescimento e centrífuga a 3.000g por cinco minutos.
Transfira a suspensão da célula para a placa e centrifuga-a por três minutos a 120g. Em seguida, incube a placa para iniciar a formação esferoide. Em seguida, equilibre o biorreator 24 horas antes de transferir os esferoides, preenchendo a câmara de umidade com 25 mililitros de água estéril e a câmara celular com nove mililitros de meio de crescimento usando uma seringa de 10 mililitros com uma agulha longa.
Em seguida, coloque o biorreator em uma incubadora 3D por 24 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Pipetar suavemente os esferoides para cima e para baixo usando pontas de furo de um mililitro de largura para desconectá-los da placa de fixação ultrabaixa e transferi-los para uma placa de cultura de tecidos. Para capturar os esferoides restantes, lave a placa com 0,5 mililitros de meio de crescimento pré-aquecido e transfira-os para a placa de cultura.
Usando um microscópio de luz, avalie o tamanho, compacidade e arredondamento dos esferoides para selecionar aqueles que estão adequadamente formados. Transfira o esferoide selecionado para o biorreator de equilíbrio preenchido com cinco mililitros de meio de crescimento fresco. Em seguida, encha todo o biorreator com meios de crescimento frescos.
Posicione o biorreator na incubadora 3D e ajuste a velocidade de rotação usando a unidade de controle. Substitua 10 mililitros de meios de crescimento antigos por 10 mililitros de meios frescos a cada dois ou três dias. Altere a velocidade de rotação sempre após substituir a mídia.
Cultivar os esferoides por 15 dias e dividi-los entre dois biorreatores frescos. Abra o aplicativo 3D instalado no tablet, selecione o biorreator e capture a imagem. Como alternativa, coloque um fundo preto atrás do biorreator e garanta que nenhuma luz seja refletida na câmara celular.
Capture a imagem o mais próximo possível do biorreator. Em seguida, colete esferoides removendo cinco mililitros de mídia do biorreator usando uma seringa presa a uma agulha longa através da porta superior. Certifique-se de que os esferoides desçam até o centro inferior do biorreator.
Agora, abra a porta frontal e colete os esferoides usando uma ponta de furo de um mililitro de largura. Transfira esses esferoides para tubos de microcentrífuga, centrifuja a 500g por cinco minutos e descarte o meio. Lave o esferoide adicionando 200 microlitros de HBSS para remover o FBS.
Depois disso, realizar a centrifugação a 500g por cinco minutos e descartar o sobrenadante. Em seguida, mergulhe o pellet esferoide rapidamente em nitrogênio líquido para congelá-lo e armazene esse pellet congelado a menos 80 graus Celsius até processamento adicional. Para lisar as células, pegue um tubo de esferoides coletados e ressuspenda-os em 25 microlitros de SDS 5%.
Homogeneizar o pellet pipetando para cima e para baixo. Em seguida, dissolver um micrograma de amostras e 10 microlitros de ácido tricloroacético a 0,1%. Após a extração da proteína e limpeza das amostras, configurar o método de aquisição de MS para gerar os espectros de MS/MS a partir dos sinais peptídicos identificados.
Em seguida, transfira a placa para o amostrador automático de cromatografia líquida de nanolitros. Defina a varredura MS completa para 300 a 1, 100 relação massa-carga no Orbitrap. Ajuste a resolução para 120000 e defina a meta de controle de ganho automático para 125.
Em seguida, defina MS/MS no Orbitrap com uma janela de isolamento sequencial de 50 relação massa-carga. Aponte a meta de controle de ganho automático em 400 e defina uma energia de dissociação colisional de maior energia de 30. De acordo com a análise de viabilidade dos esferoides, os níveis de adenilato quinase aumentam até o 17º dia, resultando em cerca de 7% de morte celular.
Depois, a taxa de mortalidade diminui para menos de 5%. A análise proteômica indicou que os esferoides THLE-3 e HepG2/C3A têm perfis semelhantes que refletem a função hepática. Adicionalmente, os esferoides apresentaram superexpressão de duas isoformas de metalotioneínas em relação às células planas.
Redes funcionalmente agrupadas mostraram enriquecimento por ontologia gênica para o processo metabólico de carboidratos em esferas HepG2/C3A e THLE-3. Para evitar o derramamento de meios de crescimento, não abra ou feche a porta frontal quando a câmara celular estiver totalmente cheia de líquido. A preparação e análise de amostras descritas neste protocolo podem ser usadas para explorar o proteoma de cultura de células usando métodos 2D e 3D, bem como amostras de tecido.
