Este protocolo demuestra cómo cultivar esferoides altamente reproducibles y muestra cómo se pueden realizar experimentos proteómicos para caracterizar la función biológica de las estructuras 3D. Nuestro cultivo 3D puede producir simultáneamente cientos de réplicas biológicas en el mismo biorreactor, y el enfoque LC-MS puede medir la abundancia de miles de proteínas en un solo experimento. Stephanie Stransky, una postdoc del laboratorio, demostrará el procedimiento.
Para comenzar, tome la suspensión de las células HepG2/C3A y THLE-3. Contar el número de células y diluir la suspensión celular en medios de crecimiento completos para obtener 1 millón de células en un volumen máximo de 1,5 mililitros. Lave los pocillos de una placa inferior redonda de 24 pocillos con 0,5 mililitros de sustrato y centrifugue a 3.000 g durante cinco minutos.
Transfiera la suspensión celular a la placa y centrifugue durante tres minutos a 120 g. Luego, incube la placa para iniciar la formación de esferoides. A continuación, equilibre el biorreactor 24 horas antes de transferir los esferoides llenando la cámara de humedad con 25 mililitros de agua estéril y la cámara celular con nueve mililitros de medio de crecimiento utilizando una jeringa de 10 mililitros con una aguja larga.
Luego, coloque el biorreactor en una incubadora 3D durante 24 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Pipetear suavemente los esferoides hacia arriba y hacia abajo con puntas de un mililitro de diámetro ancho para separarlos de la placa de fijación ultra baja y transferirlos a una placa de cultivo de tejidos. Para capturar los esferoides restantes, lave la placa con 0,5 mililitros de medio de cultivo precalentado y transfiéralos a la placa de cultivo.
Usando un microscopio óptico, evalúe el tamaño, la compacidad y la redondez de los esferoides para seleccionar los que están adecuadamente formados. Transfiera el esferoide seleccionado al biorreactor de equilibrio lleno de cinco mililitros de medios de cultivo frescos. A continuación, llene todo el biorreactor con medios de cultivo nuevos.
Coloque el biorreactor en la incubadora 3D y ajuste la velocidad de rotación con la unidad de control. Reemplace 10 mililitros de sustrato viejo por 10 mililitros de sustrato nuevo cada dos o tres días. Cambie la velocidad de rotación cada vez que reemplace el medio.
Cultive los esferoides durante 15 días y divídalos entre dos biorreactores frescos. Abra la aplicación 3D instalada en la tableta, seleccione el biorreactor y capture la imagen. Como alternativa, coloque un fondo negro detrás del biorreactor y asegúrese de que la luz no se refleje en la cámara celular.
Capture la imagen lo más cerca posible del biorreactor. Luego, recoja los esferoides retirando cinco mililitros de medio del biorreactor con una jeringa conectada a una aguja larga a través del puerto superior. Asegúrese de que los esferoides desciendan al centro inferior del biorreactor.
Ahora, abra el puerto frontal y recoja los esferoides con una punta de un mililitro de diámetro ancho. Transfiera estos esferoides a tubos de microcentrífuga, centrifugue a 500 g durante cinco minutos y deseche los medios. Lave el esferoide agregando 200 microlitros de HBSS para eliminar el FBS.
Después de esto, realice la centrifugación a 500 g durante cinco minutos y deseche el sobrenadante. Luego, sumerja el gránulo de esferoide rápidamente en nitrógeno líquido para congelarlo y almacene este gránulo congelado a menos 80 grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Para lisar las células, tome un tubo de esferoides recolectados y vuelva a suspenderlos en 25 microlitros de SDS al 5%.
Homogeneizar el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, disuelva un microgramo de muestras y 10 microlitros de ácido tricloroacético al 0,1%. Después de extraer la proteína y limpiar las muestras, configure el método de adquisición de MS para generar los espectros de MS/MS a partir de las señales peptídicas identificadas.
A continuación, transfiera la placa al muestreador automático de cromatografía líquida de nanolitros. Establezca el escaneo MS completo en una relación masa-carga de 300 a 1, 100 en el Orbitrap. Ajuste la resolución a 120000 y establezca el objetivo de control automático de ganancia en 125.
A continuación, configure MS/MS en el Orbitrap con una ventana de aislamiento secuencial de 50 de relación masa-carga. Apunte el objetivo de control automático de ganancia a 400 y establezca una energía de disociación colisional de mayor energía de 30. Según el análisis de viabilidad de los esferoides, los niveles de adenilato quinasa aumentan hasta el día 17, lo que resulta en alrededor del 7% de la muerte celular.
Posteriormente, la tasa de mortalidad disminuye por debajo del 5%Además, un análisis del primer componente principal revela una clara distinción entre muestras de esferoides y cultivos celulares planos. El análisis proteómico indicó que los esferoides THLE-3 y HepG2/C3A tienen perfiles similares que reflejan la función hepática. Además, los esferoides mostraron sobreexpresión de dos isoformas de metalotioneínas en comparación con las células planas.
Las redes agrupadas funcionalmente mostraron un enriquecimiento de la ontología génica para el proceso metabólico de carbohidratos en las esferas HepG2/C3A y THLE-3. Para evitar que el medio de crecimiento se derrame, no abra ni cierre el puerto frontal cuando la cámara celular esté completamente llena de líquido. La preparación y el análisis de muestras descritos en este protocolo se pueden utilizar para explorar el proteoma del cultivo de células utilizando métodos 2D y 3D, así como muestras de tejido.
