이 프로토콜은 재현성이 높은 스페로이드를 성장시키는 방법을 보여주고 3D 구조의 생물학적 기능을 특성화하기 위해 단백질체 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다. 당사의 3D 배양은 동일한 바이오리액터에서 수백 개의 생물학적 복제물을 동시에 생성할 수 있으며, LC-MS 접근법은 단일 실험에서 수천 개의 단백질을 측정할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 박사 후 연구원인 Stephanie Stransky입니다.

시작하려면 HepG2/C3A 및 THLE-3 세포의 현탁액을 복용하십시오. 세포 수를 계산하고 세포 현탁액을 완전 성장 배지에 희석하여 최대 부피 1.5mL에서 100만 개의 세포를 얻습니다. 성장 매체의 0.5 밀리리터를 가진 매우 낮은 부착, 24 우물 둥근 바닥 판의 우물 및 3에 5 분, 000g에 분리기를 세척하십시오.

셀 현탁액을 플레이트로 옮기고 120g에서 3분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 플레이트를 배양하여 스페로이드 형성을 시작합니다. 다음으로, 긴 바늘이 달린 10밀리리터 주사기를 사용하여 습도 챔버에 25밀리리터의 멸균수를 채우고 세포 챔버에 9밀리리터의 성장 배지를 채워 스페로이드를 옮기기 24시간 전에 바이오리액터를 평형화합니다.

그런 다음 바이오리액터를 섭씨 37도에서 24시간 동안 5% 이산화탄소로 둡니다. 1밀리리터 너비의 보어 팁을 사용하여 스페로이드를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 초저 부착판에서 분리하고 조직 배양 접시로 옮깁니다. 남아 있는 스페로이드를 포획하려면 0.5mL의 예열된 성장 배지로 플레이트를 세척하고 배양 접시로 옮깁니다.

광학 현미경을 사용하여 스페로이드의 크기, 조밀함 및 진원도를 평가하여 적절하게 형성된 스페로이드를 선택합니다. 선택한 스페로이드를 5mL의 신선한 성장 배지로 채워진 평형 바이오리액터로 옮깁니다. 그런 다음 전체 생물 반응기를 새로운 성장 배지로 채웁니다.

바이오리액터를 3D 인큐베이터에 배치하고 제어 장치를 사용하여 회전 속도를 조정합니다. 2-3일마다 10ml의 오래된 성장 배지를 10ml의 새 배지로 교체하십시오. 미디어를 교체한 후 매번 회전 속도를 변경하십시오.

15일 동안 스페로이드를 배양하고 두 개의 신선한 생물반응기로 나눕니다. 태블릿에 설치된 3D 앱을 열고 생물 반응기를 선택하고 이미지를 캡처합니다. 대안으로, 생물반응기 뒤에 검은색 배경을 배치하고 세포 챔버에 빛이 반사되지 않도록 합니다.

가능한 한 바이오리액터에 가까운 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 상단 포트를 통해 긴 바늘에 부착된 주사기를 사용하여 바이오리액터에서 5밀리리터의 배지를 제거하여 스페로이드를 수집합니다. 스페로이드가 생물반응기의 하단 중앙으로 내려가는지 확인합니다.

이제 전면 포트를 열고 1밀리리터 너비의 보어 팁을 사용하여 스페로이드를 수집합니다. 이 스페로이드를 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 500g에서 5분 동안 원심분리한 다음 배지를 폐기합니다. FBS를 제거하기 위해 200마이크로리터의 HBSS를 추가하여 스페로이드를 세척합니다.

그런 다음 500g에서 5분 동안 원심분리를 수행하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 스페로이드 펠릿을 액체 질소에 빠르게 담그어 얼리고 이 얼린 펠릿을 추가 처리할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 세포를 용해하려면 수집된 스페로이드 튜브를 25마이크로리터의 5%SDS에 재현탁시킵니다.

위아래로 피펫팅하여 펠릿을 균질화합니다. 다음으로, 1 마이크로 그램의 샘플과 10 마이크로 리터의 0.1 % 트리클로로 아세트산을 녹입니다. 단백질을 추출하고 샘플을 세척한 후 식별된 펩타이드 신호에서 MS/MS 스펙트럼을 생성하도록 MS 수집 방법을 설정합니다.

그런 다음 플레이트를 나노리터 액체 크로마토그래피 오토샘플러로 옮깁니다. Orbitrap에서 전체 MS 스캔을 300:1, 100 질량 대 전하 비율로 설정합니다. 해상도를 120000으로 조정하고 자동 게인 제어 목표를 125로 설정합니다.

그런 다음 Orbitrap에서 MS/MS를 50 질량 대 전하 비율의 순차 분리 윈도우로 설정합니다. 자동 게인 제어 목표를 400으로 조준하고 더 높은 에너지 충돌 해리 에너지를 30으로 설정합니다. 스페로이드의 생존력 분석에 따르면 아데닐레이트 키나아제의 수준은 17일까지 증가하여 약 7%의 세포 사멸을 초래합니다.

그 후 사망률은 5% 미만으로 감소하며, 첫 번째 주성분을 분석한 결과 스페로이드 샘플과 편평 세포 배양 간의 명확한 차이가 밝혀졌습니다. 단백질체 분석 결과 THLE-3 및 HepG2/C3A 스페로이드는 간 기능을 반영하는 유사한 프로필을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 또한, 스페로이드는 편평한 세포에 비해 두 가지 동형의 메탈로티오닌이 과발현되는 것을 보여주었습니다.

기능적으로 그룹화된 네트워크는 HepG2/C3A 및 THLE-3 구체에서 탄수화물 대사 과정에 대한 유전자 온톨로지 농축을 보여주었습니다. 성장 배지가 쏟아지는 것을 방지하려면 셀 챔버가 액체로 완전히 채워졌을 때 전면 포트를 열거나 닫지 마십시오. 이 프로토콜에 설명된 샘플 준비 및 분석은 조직 샘플뿐만 아니라 2D 및 3D 방법을 사용하여 세포 배양의 단백질체를 탐색하는 데 사용할 수 있습니다.