Bu protokol, yüksek oranda tekrarlanabilir sferoidlerin nasıl yetiştirileceğini ve 3D yapıların biyolojik işlevini karakterize etmek için proteomik deneylerin nasıl yapılabileceğini gösterir. 3D kültürümüz aynı biyoreaktörde aynı anda yüzlerce biyolojik kopya üretebilir ve LC-MS yaklaşımı, tek bir deneyde binlerce proteinin bolluğunu ölçebilir. Prosedürü gösteren, laboratuvardan bir postdoc olan Stephanie Stransky olacak.
Başlamak için, HepG2 / C3A ve THLE-3 hücrelerinin süspansiyonunu alın. Hücre sayısını sayın ve maksimum 1.5 mililitre hacimde 1 milyon hücre elde etmek için hücre süspansiyonunu tam büyüme ortamında seyreltin. Ultra düşük ataşman, 24 oyuklu yuvarlak alt plakanın kuyularını 0,5 mililitre büyüme ortamı ile yıkayın ve beş dakika boyunca 3.000 g'da santrifüjleyin.
Hücre süspansiyonunu plakaya aktarın ve 120 g'da üç dakika santrifüjleyin. Ardından, küresel oluşumu başlatmak için plakayı inkübe edin. Daha sonra, uzun bir iğne ile 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak nem odasını 25 mililitre steril su ve hücre odasını dokuz mililitre büyüme ortamı ile doldurarak sferoidleri aktarmadan 24 saat önce biyoreaktörü dengeleyin.
Ardından, biyoreaktörü %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 24 saat boyunca 3D inkübatöre yerleştirin. Sferoidleri ultra düşük bağlantı plakasından ayırmak için bir mililitre genişliğinde delikler kullanarak yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin ve bir doku kültürü kabına aktarın. Kalan sferoidleri yakalamak için, plakayı 0,5 mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile yıkayın ve bunları kültür kabına aktarın.
Bir ışık mikroskobu kullanarak, yeterince şekillendirilmiş olanları seçmek için sferoidlerin boyutunu, kompaktlığını ve yuvarlaklığını değerlendirin. Seçilen sferoidi, beş mililitre taze büyüme ortamı ile doldurulmuş dengeleyici biyoreaktöre aktarın. Ardından, tüm biyoreaktörü taze büyüme ortamıyla doldurun.
Biyoreaktörü 3D inkübatöre yerleştirin ve kontrol ünitesini kullanarak dönüş hızını ayarlayın. Her iki ila üç günde bir 10 mililitre eski büyüme ortamını 10 mililitre taze ortamla değiştirin. Ortamı değiştirdikten sonra her seferinde dönüş hızını değiştirin.
Sferoidleri 15 gün boyunca kültürleyin ve iki yeni biyoreaktör arasında bölün. Tablette yüklü olan 3D uygulamasını açın, biyoreaktörü seçin ve görüntüyü yakalayın. Alternatif olarak, biyoreaktörün arkasına siyah bir arka plan yerleştirin ve hücre odasına ışık yansımadığından emin olun.
Görüntüyü biyoreaktöre mümkün olduğunca yakın bir şekilde yakalayın. Ardından, üst porttan uzun bir iğneye bağlı bir şırınga kullanarak biyoreaktörden beş mililitre ortam çıkararak sferoidleri toplayın. Kürelerin biyoreaktörün alt merkezine indiğinden emin olun.
Şimdi, ön portu açın ve bir mililitre genişliğinde bir delik ucu kullanarak sferoidleri toplayın. Bu sferoidleri mikro santrifüj tüplerine aktarın, 500 g'da beş dakika santrifüjleyin ve ortamı atın. FBS'yi çıkarmak için 200 mikrolitre HBSS ekleyerek sferoidi yıkayın.
Bundan sonra, beş dakika boyunca 500 g'de santrifüjleme yapın ve süpernatanı atın. Daha sonra, küresel peleti dondurmak için hızla sıvı nitrojene daldırın ve bu donmuş peleti daha sonraki işlemlere kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hücreleri parçalamak için, toplanan sferoidlerden oluşan bir tüp alın ve bunları 25 mikrolitre% 5 SDS içinde yeniden süspanse edin.
Yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti homojenize edin. Daha sonra, bir mikrogram numuneyi ve 10 mikrolitre% 0.1 trikloroasetik asidi çözün. Proteini çıkardıktan ve numuneleri temizledikten sonra, tanımlanan peptit sinyallerinden MS/MS spektrumlarını oluşturmak için MS toplama yöntemini ayarlayın.
Ardından, plakayı nanolitre sıvı kromatografi otomatik örnekleyiciye aktarın. Orbitrap'te tam MS taramasını 300'e 1, 100 kütle-şarj oranına ayarlayın. Çözünürlüğü 120000 olarak ayarlayın ve otomatik kazanç kontrol hedefini 125 olarak ayarlayın.
Ardından, MS/MS'yi Orbitrap'te 50 kütle-yük oranına sahip sıralı bir izolasyon penceresiyle ayarlayın. Otomatik kazanç kontrol hedefini 400'e hedefleyin ve 30'luk daha yüksek bir enerjili çarpışma ayrışma enerjisi ayarlayın. Sferoidlerin canlılık analizine göre, adenilat kinaz seviyeleri 17. güne kadar artar ve hücre ölümünün yaklaşık% 7'sine neden olur.
Daha sonra, ölüm oranı %5'in altına düşerAyrıca, ilk ana bileşenin analizi, sferoid numuneler ile düz hücre kültürleri arasında net bir ayrım ortaya koymaktadır. Proteomik analiz, THLE-3 ve HepG2/C3A sferoidlerinin karaciğer fonksiyonunu yansıtan benzer profillere sahip olduğunu gösterdi. Ek olarak, sferoidler, düz hücrelere kıyasla iki metallotiyonin izoformunun aşırı ekspresyonunu gösterdi.
İşlevsel olarak gruplandırılmış ağlar, HepG2/C3A ve THLE-3 kürelerinde karbonhidrat metabolik süreci için gen ontolojisi zenginleşmesi gösterdi. Büyüme ortamının dökülmesini önlemek için, hücre odası tamamen sıvıyla dolduğunda ön bağlantı noktasını açmayın veya kapatmayın. Bu protokolde açıklanan numune hazırlama ve analiz, doku örneklerinin yanı sıra 2D ve 3D yöntemler kullanılarak hücre kültürünün proteomunu keşfetmek için kullanılabilir.
