אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים

מטרת כתב היד הייתה להעריך את התאמת הכימות הסימולטני של מוקדי גמא H2AX ו-53BP1 כדי להעריך את הנזק הגנומי שנגרם בלימפוציטים היקפיים אנושיים על ידי בלומיצין. מספר גורמים יכולים לגרום לשברים כפולים. התאים מקבלים אפוא מספר מנגנוני תיקון, המערבים גם גמא H2AX וגם 53 חלבון קושר 1, שיכולים למקם יחד ליד שבר הגדיל הכפול.

לאחר איסוף דגימות דם שלמות, להוסיף 300 מיקרוליטר של מדגם לצינור המכיל 4.7 מיליליטר של מדיום מלא. לאחר מכן להוסיף חמישה מיקרוגרם למיליליטר של ריכוז הסופי של בלומיצין סולפט. עבור כל דגימה, הגדר פקד שלילי.

שים את הצינור בתרמוסטט ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. דגימות צנטריפוגות ב 540 גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון hypotonic לכדור.

לאחר מכן להוסיף 400 מיקרוליטר של פתרון מראש קיבוע על מנת לגרום המוליזה. דגימות צנטריפוגות ב 540 גרם במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשהות מחדש גלולה בחמישה מיליליטר מתנול בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות כדי לתקן את התאים. דגימות צנטריפוגות ב 540 גרם במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשהות מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של פתרון קיבוע.

חזור על שלב זה פעם נוספת. צנטריפוגה שוב ב 540 G במשך חמש דקות, ואז לשאוף supernatant משאיר מספיק פתרון כדי להשהות מחדש את הכדור. שחרר את גלולת התא התלויה מחדש על המגלשות.

הכינו את שתי התמיסות המכילות את האנטי-גמא H2AX ואת האנטי-53BP1 הנוגדנים הראשוניים המומסים בתמיסת חסימה. לאחר מכן שטפו שקופיות פעמיים ב-PBS 1X. לאחר מכן שמור שקופיות למשך 30 דקות בתמיסת חסימה.

הוסף לכל שקופית 10 מיקרוליטר של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים הראשוניים המומסים בתמיסת חסימה. כסו את השקופיות בפרפילם. דוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר הדגירה, בצע שלוש שטיפות ב- PBS 1X במשך חמש דקות. הכינו את שתי התמיסות המכילות נוגדנים משניים DyLight 488 ו-Alexa Fluor 568 המומסים בתמיסת חסימה. לאחר מכן הוסף לכל שקופית 10 מיקרוליטר של כל אחת משתי התמיסות המכילות את הנוגדנים המשניים המומסים בתמיסת חסימה.

מכסים את המגלשות בפרפילם ודגרים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר הדגירה השנייה, בצעו שלוש שטיפות ב-PBS 1X במשך חמש דקות. הוסף 2.5 מיקרוליטר של תמיסת Antifade עם DAPI על פתקי הכיסוי לפני ההרכבה כדי למנוע כתמים של הגרעינים.

על מנת להעריך מוקדים קינטיים, ההליך זהה למתואר כעת. השלב האחרון הוא תצפית וכימות מוקדים. לימפוציטים אנושיים ללא מוקדי גמא H2AX ו-53BP1 מוצגים ב-A, ב-B, וב-C מוצגים לימפוציטים אנושיים עם כמויות שונות של מוקדי גמא H2AX ו-53BP1.

זה נצפתה רמה נמוכה של לוקליזציה משותפת מוקדים. כצפוי, תדירות גבוהה מאוד של מוקדי גמא H2AX ו- 53BP1 נצפים בין תאים לא מטופלים. כמו כן, הבדל גדול נצפה במספר המוקדים של שני הסמנים.

מהלך הזמן של מוקדי גמא H2AX ו- 53BP1 לאורך זמן הראה התנהגות שונה למרות שהם תורמים לאותה פונקציה. לניתוח מוקדי גמא H2AX ו-53BP1 יש את היכולת להעריך את התגובה התאית בחשיפה או בהקשרים פתולוגיים. עם זאת, גמא H2AX ו 53BP1 כפול immunofluorescence יכול להוביל לזלזל בתדירות האמיתית של האירוע.