El objetivo de este manuscrito fue evaluar la idoneidad de la cuantificación simultánea de focos Gamma H2AX y 53BP1 para evaluar el daño genómico inducido en linfocitos periféricos humanos por bleomicina. Varios factores pueden causar roturas de doble hebra. Por lo tanto, las células cuentan con varios mecanismos de reparación, que involucran tanto a Gamma H2AX como a la proteína de unión 53 1, que pueden colocalizarse cerca de la rotura de doble cadena.
Después de recolectar muestras de sangre entera, agregue 300 microlitros de muestra a un tubo que contenga 4.7 mililitros de medio completo. Luego agregue cinco microgramos por mililitro de concentración final de sulfato de bleomicina. Para cada muestra, configure un control negativo.
Coloque el tubo en un termostato a 37 grados centígrados durante dos horas. Centrifugar muestras a 540 G durante cinco minutos. Luego agregue cinco mililitros de solución hipotónica al pellet.
Luego agregue 400 microlitros de solución prefijadora para causar hemólisis. Centrifugar muestras a 540 G durante cinco minutos, luego resuspender el pellet en cinco mililitros de metanol a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos para fijar las células. Centrifugar muestras a 540 G durante cinco minutos, luego resuspender el pellet en cinco mililitros de solución fijadora.
Repita este paso una vez más. Centrifugar de nuevo a 540 G durante cinco minutos, luego aspirar el sobrenadante dejando suficiente solución para resuspender el pellet. Deje caer el pellet de celda resuspendida en los portaobjetos.
Preparar las dos soluciones que contienen los anticuerpos primarios anti-Gamma H2AX y anti-53BP1 disueltos en solución de bloqueo. Luego lave las diapositivas dos veces en PBS 1X. Luego mantenga las diapositivas durante 30 minutos en solución de bloqueo.
Añadir a cada portaobjetos 10 microlitros de cada una de las dos soluciones que contienen los anticuerpos primarios disueltos en solución bloqueante. Cubra las diapositivas con parafilm. Incubar a cuatro grados centígrados durante la noche.
Después de la incubación, realice tres lavados en PBS 1X durante cinco minutos. Prepare las dos soluciones que contienen los anticuerpos secundarios DyLight 488 y Alexa Fluor 568 disueltos en solución de bloqueo. Luego agregue a cada portaobjetos 10 microlitros de cada una de las dos soluciones que contienen los anticuerpos secundarios disueltos en solución de bloqueo.
Cubra los portaobjetos con parafilm e incubar a temperatura ambiente durante dos horas. Después de esta segunda incubación, realice tres lavados en PBS 1X durante cinco minutos. Agregue 2,5 microlitros de solución Antifade con DAPI en los cubreobjetos antes del montaje para contrarrestar las manchas de los núcleos.
Para evaluar la cinética de los focos, el procedimiento es el mismo que ahora se describe. La última fase es la observación y cuantificación de focos. Los linfocitos humanos sin focos Gamma H2AX y 53BP1 se muestran en A, en B y en C, se muestran linfocitos humanos con diferentes cantidades de focos Gamma H2AX y 53BP1.
Se observa un bajo nivel de colocalización de focos. Como era de esperar, se observa una frecuencia muy alta de focos Gamma H2AX y 53BP1 entre las células no tratadas no tratadas. Además, se observa una gran diferencia en el número de focos de los dos marcadores.
El curso temporal de los focos Gamma H2AX y 53BP1 a lo largo del tiempo mostró un comportamiento diferente aunque contribuyen a la misma función. El análisis de focos gamma H2AX y 53BP1 tiene la capacidad de evaluar la respuesta celular en contextos de exposición o patológicos. Sin embargo, la inmunofluorescencia dual Gamma H2AX y 53BP1 puede llevar a subestimar la verdadera frecuencia del evento.
