Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos

O objetivo deste artigo foi avaliar a adequação da quantificação simultânea dos focos Gamma H2AX e 53BP1 para avaliar o dano genômico induzido em linfócitos periféricos humanos pela bleomicina. Vários fatores podem causar quebras de dupla corda. As células são, portanto, providas de vários mecanismos de reparo, envolvendo tanto a Gamma H2AX quanto a 53 Binding Protein 1, que podem co-localizar perto da quebra da fita dupla.

Após a coleta de amostras de sangue total, adicionar 300 microlitros de amostra a um tubo contendo 4,7 mililitros de meio completo. Em seguida, adicione cinco microgramas por mililitro de concentração final de sulfato de bleomicina. Para cada amostra, estabelecer um controle negativo.

Coloque o tubo em um termostato a 37 graus Celsius por duas horas. Centrifugar amostras a 540 G durante cinco minutos. Em seguida, adicione cinco mililitros de solução hipotônica ao pellet.

Em seguida, adicione 400 microlitros de solução pré-fixativa para causar hemólise. Centrifugar amostras a 540 G por cinco minutos e, em seguida, ressuspender o pellet em cinco mililitros de metanol à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos para fixar as células. Centrifugar amostras a 540 G por cinco minutos e, em seguida, ressuspender o pellet em cinco mililitros de solução fixadora.

Repita esta etapa mais uma vez. Centrifugar novamente a 540 G por cinco minutos, em seguida, aspirar o sobrenadante deixando solução suficiente para ressuspender a pastilha. Solte a pastilha de célula ressuspensa nas lâminas.

Preparar as duas soluções contendo os anticorpos primários anti-Gamma H2AX e anti-53BP1 dissolvidos em solução de bloqueio. Em seguida, lave as lâminas duas vezes em PBS 1X. Em seguida, mantenha as lâminas por 30 minutos em solução de bloqueio.

Adicionar a cada lâmina 10 microlitros de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos primários dissolvidos em solução de bloqueio. Cubra as lâminas com parafilme. Incubar a quatro graus Celsius durante a noite.

Após a incubação, realizar três lavagens em PBS 1X por cinco minutos. Preparar as duas soluções contendo os anticorpos secundários DyLight 488 e Alexa Fluor 568 dissolvidos em solução de bloqueio. Em seguida, adicione a cada lâmina 10 microlitros de cada uma das duas soluções contendo os anticorpos secundários dissolvidos em solução de bloqueio.

Cubra as lâminas com parafilme e incube à temperatura ambiente por duas horas. Após esta segunda incubação, realizar três lavagens em PBS 1X por cinco minutos. Adicionar 2,5 microlitros de solução Antifade com DAPI nas lamínulas da tampa antes da montagem para combater a mancha dos núcleos.

Para avaliar a cinética dos focos, o procedimento é o mesmo descrito anteriormente. A última fase é a observação e quantificação dos focos. Linfócitos humanos sem focos de Gamma H2AX e 53BP1 são mostrados em A, em B, e em C, linfócitos humanos com diferentes quantidades de focos de Gamma H2AX e 53BP1 são mostrados.

Observa-se baixo nível de co-localização dos focos. Como esperado, uma frequência muito maior de ambos os focos de Gamma H2AX e 53BP1 são observados entre as células não tratadas não tratadas. Observa-se, ainda, grande diferença no número de focos dos dois marcadores.

O curso temporal dos focos de Gamma H2AX e 53BP1 ao longo do tempo mostrou um comportamento diferente, embora contribuam para a mesma função. A análise dos focos de gama H2AX e 53BP1 tem a capacidade de avaliar a resposta celular em contextos de exposição ou patológicos. No entanto, a imunofluorescência dupla com Gamma H2AX e 53BP1 pode subestimar a verdadeira frequência do evento.