人外周淋巴细胞中γH2AX和53BP1的双重免疫荧光

本手稿的目的是评估同时定量 Gamma H2AX 和 53BP1 病灶的适用性，以评估博来霉素诱导的人外周淋巴细胞的基因组损伤。有几个因素会导致双链断裂。因此，细胞具有几种修复机制，涉及γ H2AX和53结合蛋白1，它们可以在双链断裂附近共定位。

收集全血样本后，将300微升样本加入含有4.7毫升完整培养基的管中。然后每毫升加入5微克终浓度的硫酸博来霉素。对于每个样品，设置阴性对照。

将管子放入 37 摄氏度的恒温器中两个小时。将样品以 540 G 离心五分钟。然后在沉淀中加入五毫升低渗溶液。

然后加入400微升固定前溶液，以引起溶血。将样品以540 G离心5分钟，然后在室温下将沉淀重悬于5毫升甲醇中至少30分钟以固定细胞。将样品以540 G离心5分钟，然后将沉淀重悬于5毫升固定溶液中。

再次重复此步骤。再次以540 G离心五分钟，然后吸出上清液，留下足够的溶液以重悬沉淀。将重悬的细胞沉淀放在载玻片上。

制备含有溶解在封闭溶液中的抗 γ H2AX 和抗 53BP1 一抗的两种溶液。然后在PBS 1X中清洗载玻片两次。然后将载玻片在封闭溶液中保持30分钟。

向每张载片中加入10微升含有溶解在封闭溶液中的一抗的两种溶液中的每一种。用封口膜覆盖幻灯片。在四摄氏度下孵育过夜。

孵育后，在PBS 1X中进行三次洗涤，持续五分钟。制备含有溶解在封闭溶液中的DyLight 488和Alexa Fluor 568二抗的两种溶液。然后向每张载玻片中加入10微升含有溶解在封闭溶液中的二抗的两种溶液。

用封口膜覆盖载玻片，并在室温下孵育两个小时。第二次孵育后，在PBS 1X中进行三次洗涤五分钟。组装前在盖玻片上加入 2.5 微升带有 DAPI 的抗淬灭溶液，以对抗细胞核染色。

为了评估病灶动力学，该过程与现在描述的相同。最后一个阶段是观察和量化病灶。没有 γ H2AX 和 53BP1 病灶的人淋巴细胞显示在 A、B 和 C 中，显示了具有不同量 γ H2AX 和 53BP1 病灶的人淋巴细胞。

观察到低水平的病灶共定位。正如预期的那样，在未处理的未处理细胞之间观察到更高的伽玛H2AX和53BP1病灶频率。此外，观察到两个标记的病灶数量存在很大差异。

Gamma H2AX和53BP1病灶随时间推移的时间过程显示出不同的行为，尽管它们对功能有贡献。伽玛H2AX和53BP1病灶分析能够评估暴露或病理背景下的细胞反应。然而，伽玛H2AX和53BP1双重免疫荧光可能导致低估事件的真实频率。