ヒト末梢リンパ球におけるγH2AXと53BP1の二重免疫蛍光法

この原稿の目的は、ブレオマイシンによってヒト末梢リンパ球に誘発されるゲノム損傷を評価するためのガンマH2AXと53BP1病巣の同時定量の適合性を評価することでした。いくつかの要因が二本鎖の断線を引き起こす可能性があります。したがって、細胞には、ガンマH2AXと53結合タンパク質1の両方を含むいくつかの修復メカニズムがあり、二本鎖切断の近くで共局在することができます。

全血サンプルを収集した後、4.7ミリリットルの完全培地を含むチューブに300マイクロリットルのサンプルを追加します。次に、硫酸ブレオマイシンの最終濃度のミリリットルあたり5マイクログラムを追加します。サンプルごとに、ネガティブコントロールを設定します。

チューブを摂氏37度のサーモスタットに2時間入れます。サンプルを540 Gで5分間遠心分離します。次に、5ミリリットルの低張溶液をペレットに加えます。

次に溶血を引き起こすために400マイクロリットルの前固定液を加えます。サンプルを540 Gで5分間遠心分離し、ペレットを5ミリリットルのメタノールに室温で少なくとも30分間再懸濁して細胞を固定します。サンプルを540 Gで5分間遠心分離し、ペレットを5ミリリットルの固定液に再懸濁します。

この手順をもう一度繰り返します。再び540Gで5分間遠心分離し、ペレットを再懸濁するのに十分な溶液を残して上清を吸引します。再懸濁した細胞ペレットをスライドに落とします。

ブロッキング溶液に溶解した抗ガンマH2AXおよび抗53BP1一次抗体を含む2つの溶液を調製します。次に、スライドをPBS 1Xで2回洗浄します。次に、スライドをブロッキング溶液に30分間保持します。

ブロッキング溶液に溶解した一次抗体を含む2つの溶液のそれぞれを各スライドに10マイクロリットル加えます。スライドをパラフィルムで覆います。摂氏4度で一晩インキュベートします。

インキュベーション後、PBS 1Xで5分間3回洗浄を行います。ブロッキング溶液に溶解したDyLight 488およびAlexa Fluor 568二次抗体を含む2つの溶液を調製します。次に、ブロッキング溶液に溶解した二次抗体を含む2つの溶液のそれぞれ10マイクロリットルを各スライドに加えます。

スライドをパラフィルムで覆い、室温で2時間インキュベートする。この2回目のインキュベーションの後、PBS 1Xで5分間3回の洗浄を行います。組み立て前にカバースリップにDAPIを含む2.5マイクロリットルの退色防止溶液を追加して、核をカウンターステインします。

病巣動態を評価するために、手順は現在記載されているものと同じである。最後の段階は病巣の観察と定量化です。ガンマH2AXおよび53BP1病巣を持たないヒトリンパ球は、A、Bに示され、Cでは、異なる量のガンマH2AXおよび53BP1病巣を有するヒトリンパ球が示されている。

低レベルの病巣共局在が観察される。予想通り、未処理の未処理細胞間では、ガンマH2AXおよび53BP1病巣の両方の非常に高い頻度が観察される。また、2つのマーカーの病巣の数にも大きな差が見られる。

ガンマH2AXと53BP1病巣の経時変化は、同じ機能に寄与しているものの、異なる挙動を示した。ガンマH2AXおよび53BP1病巣分析は、曝露または病理学的状況のいずれかで細胞応答を評価する能力を有する。ただし、ガンマH2AXおよび53BP1二重免疫蛍光は、イベントの真の頻度を過小評価する可能性があります。