Lo scopo di questo manoscritto era quello di valutare l'idoneità della quantificazione simultanea dei focolai di Gamma H2AX e 53BP1 per valutare il danno genomico indotto nei linfociti periferici umani dalla bleomicina. Diversi fattori possono causare rotture del doppio filamento. Le cellule sono quindi dotate di diversi meccanismi di riparazione, che coinvolgono sia Gamma H2AX che 53 Binding Protein 1, che possono co-localizzarsi vicino alla rottura del doppio filamento.
Dopo aver raccolto campioni di sangue intero, aggiungere 300 microlitri di campione a una provetta contenente 4,7 millilitri di terreno completo. Quindi aggiungere cinque microgrammi per millilitro di bleomicina solfato concentrazione finale. Per ogni campione, impostare un controllo negativo.
Metti il tubo in un termostato a 37 gradi Celsius per due ore. Centrifugare i campioni a 540 G per cinque minuti. Quindi aggiungere cinque millilitri di soluzione ipotonica al pellet.
Quindi aggiungere 400 microlitri di soluzione prefissativa per causare l'emolisi. Centrifugare i campioni a 540 G per cinque minuti, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di metanolo a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per fissare le cellule. Centrifugare i campioni a 540 G per cinque minuti, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di soluzione fissativa.
Ripeti questo passaggio ancora una volta. Centrifugare nuovamente a 540 g per cinque minuti, quindi aspirare il surnatante lasciando una soluzione sufficiente per risospendere il pellet. Far cadere il pellet cellulare risospeso sui vetrini.
Preparare le due soluzioni contenenti gli anticorpi primari anti-Gamma H2AX e anti-53BP1 disciolti in soluzione bloccante. Quindi lavare i vetrini due volte in PBS 1X. Quindi conservare i vetrini per 30 minuti nella soluzione di blocco.
Aggiungere ad ogni vetrino 10 microlitri di ciascuna delle due soluzioni contenenti gli anticorpi primari disciolti in soluzione bloccante. Coprire le diapositive con parafilm. Incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.
Dopo l'incubazione, eseguire tre lavaggi in PBS 1X per cinque minuti. Preparare le due soluzioni contenenti gli anticorpi secondari DyLight 488 e Alexa Fluor 568 disciolti in soluzione bloccante. Quindi aggiungere a ciascun vetrino 10 microlitri di ciascuna delle due soluzioni contenenti gli anticorpi secondari disciolti in soluzione bloccante.
Coprire i vetrini con parafilm e incubare a temperatura ambiente per due ore. Dopo questa seconda incubazione, eseguire tre lavaggi in PBS 1X per cinque minuti. Aggiungere 2,5 microlitri di soluzione Antifade con DAPI sui vetrini di copertura prima del montaggio per contrastare la macchia dei nuclei.
Al fine di valutare la cinetica dei fuochi, la procedura è la stessa descritta ora. L'ultima fase è l'osservazione e la quantificazione dei focolai. I linfociti umani senza focolai di Gamma H2AX e 53BP1 sono mostrati in A, in B e in C, sono mostrati linfociti umani con diverse quantità di focolai di Gamma H2AX e 53BP1.
Si osserva un basso livello di co-localizzazione dei fuochi. Come previsto, si osserva una frequenza molto più elevata di focolai di Gamma H2AX e 53BP1 tra le cellule non trattate non trattate. Inoltre, si osserva una grande differenza nel numero di fuochi dei due marcatori.
Il decorso temporale dei fuochi di Gamma H2AX e 53BP1 nel tempo ha mostrato un comportamento diverso sebbene contribuiscano alla stessa funzione. L'analisi dei focolai di gamma H2AX e 53BP1 ha la capacità di valutare la risposta cellulare sia in contesti di esposizione che patologici. Tuttavia, la doppia immunofluorescenza Gamma H2AX e 53BP1 può portare a sottostimare la vera frequenza dell'evento.
