Цель данной рукописи состояла в том, чтобы оценить пригодность одновременного количественного определения очагов Gamma H2AX и 53BP1 для оценки геномного повреждения, индуцированного блеомицином в периферических лимфоцитах человека. Несколько факторов могут вызвать разрывы двойной пряди. Таким образом, клетки снабжены несколькими механизмами репарации, включающими как Gamma H2AX, так и 53-связывающий белок 1, которые могут совместно локализоваться вблизи разрыва двойной цепи.
После сбора образцов цельной крови добавьте 300 микролитров образца в пробирку, содержащую 4,7 миллилитра полной среды. Затем добавьте пять микрограммов на миллилитр конечной концентрации сульфата блеомицина. Для каждого образца настройте отрицательный контроль.
Поместите трубку в термостат при температуре 37 градусов Цельсия на два часа. Центрифуга пробы при 540 г в течение пяти минут. Затем добавьте в гранулу пять миллилитров гипотонического раствора.
Затем добавляют 400 микролитров предварительно фиксирующего раствора, чтобы вызвать гемолиз. Центрифугу пробуют при 540 G в течение пяти минут, затем ресуспендируют гранулы в пяти миллилитрах метанола при комнатной температуре в течение не менее 30 минут для фиксации ячеек. Центрифугу пробуют при 540 г в течение пяти минут, затем ресуспендируют гранулы в пяти миллилитрах фиксирующего раствора.
Повторите этот шаг еще раз. Снова центрифугу при 540 г в течение пяти минут, затем вдохните надосадочную жидкость, оставив достаточно раствора для ресуспендирования гранул. Бросьте ресуспендированную гранулу ячейки на предметные стекла.
Приготовьте два раствора, содержащие первичные антитела против Gamma H2AX и анти-53BP1, растворенные в блокирующем растворе. Затем вымойте предметные стекла два раза в PBS 1X. Затем держите слайды в течение 30 минут в блокирующем растворе.
Добавьте к каждому предметному стеклу по 10 микролитров каждого из двух растворов, содержащих первичные антитела, растворенные в блокирующем растворе. Накройте слайды парапленкой. Инкубировать при четырех градусах Цельсия в течение ночи.
После инкубации выполните три промывки в PBS 1X в течение пяти минут. Приготовьте два раствора, содержащие вторичные антитела DyLight 488 и Alexa Fluor 568, растворенные в блокирующем растворе. Затем добавляют к каждому предметному стеклу по 10 микролитров каждого из двух растворов, содержащих вторичные антитела, растворенные в блокирующем растворе.
Накройте предметные стекла парапленкой и выдерживайте при комнатной температуре в течение двух часов. После этой второй инкубации выполните три промывки в PBS 1X в течение пяти минут. Перед сборкой добавьте 2,5 микролитра раствора Antifade с DAPI на покровных листах, чтобы противостоять окрашиванию ядер.
Для того, чтобы оценить кинетическую направленность очагов, процедура такая же, как сейчас описана. Последним этапом является наблюдение и количественная оценка очагов. Лимфоциты человека без очагов Gamma H2AX и 53BP1 показаны в А, в В и в С, показаны лимфоциты человека с различным количеством очагов Gamma H2AX и 53BP1.
Наблюдается низкий уровень колокализации очагов. Как и ожидалось, очень высокая частота очагов Gamma H2AX и 53BP1 наблюдается между необработанными необработанными клетками. Также большая разница наблюдается в количестве очагов двух маркеров.
Временной ход фокусов Gamma H2AX и 53BP1 с течением времени показал разное поведение, хотя они вносят свой вклад в одну и ту же функцию. Анализ очагов Gamma H2AX и 53BP1 позволяет оценить клеточный ответ как в условиях воздействия, так и в патологическом контексте. Однако Gamma H2AX и двойная иммунофлуоресценция 53BP1 могут привести к недооценке истинной частоты события.
