Das Ziel dieses Manuskripts war es, die Eignung der simultanen Quantifizierung von Gamma H2AX und 53BP1 Foci zu evaluieren, um die genomische Schädigung zu beurteilen, die in humanen peripheren Lymphozyten durch Bleomycin induziert wird. Mehrere Faktoren können Doppelstrangbrüche verursachen. Die Zellen verfügen somit über mehrere Reparaturmechanismen, an denen sowohl Gamma H2AX als auch das 53 Binding Protein 1 beteiligt sind, die in der Nähe des Doppelstrangbruchs kolokalisieren können.
Nach der Entnahme von Vollblutproben werden 300 Mikroliter der Probe in ein Röhrchen mit 4,7 Millilitern Komplettmedium gegeben. Fügen Sie dann fünf Mikrogramm pro Milliliter Bleomycinsulfat-Endkonzentration hinzu. Richten Sie für jede Probe eine Negativkontrolle ein.
Stecken Sie das Röhrchen für zwei Stunden in einen Thermostat bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben bei 540 G für fünf Minuten. Fügen Sie dann fünf Milliliter hypotone Lösung zum Pellet hinzu.
Fügen Sie dann 400 Mikroliter präfixative Lösung hinzu, um eine Hämolyse zu bewirken. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 540 g und resuspendieren Sie dann das Pellet in fünf Millilitern Methanol bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten, um die Zellen zu fixieren. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 540 g und resuspendieren Sie das Pellet dann in fünf Millilitern Fixierlösung.
Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Zentrifugieren Sie erneut fünf Minuten lang bei 540 g und saugen Sie dann den Überstand an, so dass genügend Lösung übrig bleibt, um das Pellet zu resuspendieren. Lassen Sie das resuspendierte Zellpellet auf die Objektträger fallen.
Bereiten Sie die beiden Lösungen vor, die die in Blockierlösung gelösten Anti-Gamma-H2AX- und Anti-53BP1-Primärantikörper enthalten. Waschen Sie dann die Objektträger zweimal in PBS 1X. Bewahren Sie die Objektträger dann 30 Minuten lang in Blockierlösung auf.
Fügen Sie jedem Objektträger 10 Mikroliter jeder der beiden Lösungen hinzu, die die in der Blockierungslösung gelösten Primärantikörper enthalten. Decken Sie die Dias mit Parafilm ab. Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.
Führen Sie nach der Inkubation drei Waschgänge in PBS 1X für fünf Minuten durch. Bereiten Sie die beiden Lösungen vor, die die in Blockierlösung gelösten Sekundärantikörper DyLight 488 und Alexa Fluor 568 enthalten. Fügen Sie dann zu jedem Objektträger 10 Mikroliter jeder der beiden Lösungen hinzu, die die in Blockierlösung gelösten Sekundärantikörper enthalten.
Decken Sie die Objektträger mit Parafilm ab und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach dieser zweiten Inkubation führen Sie drei Waschgänge in PBS 1X für fünf Minuten durch. Fügen Sie vor dem Zusammenbau 2,5 Mikroliter Antifade-Lösung mit DAPI auf die Deckgläser hinzu, um der Verfärbung der Kerne entgegenzuwirken.
Um die Herdkinetik beurteilen zu können, ist die Vorgehensweise die gleiche wie jetzt beschrieben. Die letzte Phase ist die Beobachtung und Quantifizierung der Herde. Humane Lymphozyten ohne Gamma-H2AX- und 53BP1-Herd sind in A, in B und in C sind humane Lymphozyten mit unterschiedlichen Mengen an Gamma-H2AX- und 53BP1-Foci dargestellt.
Es wird eine geringe Kolokalisation der Herde beobachtet. Erwartungsgemäß wird eine sehr höhere Häufigkeit von Gamma H2AX- und 53BP1-Foci zwischen unbehandelten unbehandelten Zellen beobachtet. Auch in der Anzahl der Brennpunkte der beiden Marker ist ein großer Unterschied zu beobachten.
Der zeitliche Verlauf von Gamma H2AX und 53BP1 Foci über die Zeit zeigte ein unterschiedliches Verhalten, obwohl sie zur gleichen Funktion beitragen. Die Gamma-H2AX- und 53BP1-Foci-Analyse ist in der Lage, die zelluläre Reaktion entweder in Expositions- oder pathologischen Kontexten zu bewerten. Die duale Immunfluoreszenz von Gamma H2AX und 53BP1 kann jedoch dazu führen, dass die tatsächliche Häufigkeit des Ereignisses unterschätzt wird.
