הקיצורים המשמשים בפרוטוקול מפורטים בטבלה משלימה 1.
1. הכנת פתרונות ומאגרים
הערה: הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים.
<ol><li>הכינו תמיסת 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 על ידי הוספת 1 מ"ל של 1 M Tris-HCl, pH 8.0 לתוך 9 מ"ל של מים נטולי יונים, בבקבוקון זכוכית, וערבבו היטב על ידי מערבולת. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים.</li>
	<li>הכן 24 mM נתרן deoxycholate (SDC) על ידי המסת 10 מ"ג של SDC ב 1 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0.</li>
	<li>הכן 24 mM נתרן lauroyl sarcosinate (SLS) על ידי המסת 7 מ"ג של SLS ב 1 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0.</li>
	<li>הכן את מאגר elution על-ידי ערבוב SDC של 24 mM ו- SLS של 24 mM ביחס של 1:1 (v/v).</li>
	<li>הכינו 50 נ"ג/מיקרוליטר של תמיסת טריפסין על ידי הוספת 400 מיקרוליטר מים שעברו דה-יוניזציה ל-20 מיקרוגרם טריפסין.</li>
	<li>הכן 25 מ"ג / מ"ל dithiothreitol (DTT) על ידי הוספת 308 μL של 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, לתוך 7.7 מ"ג של DTT.</li>
	<li>הכינו 0.25 M יודואצטמיד (IAM) על ידי הוספת 1.2 מ"ל של 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, לתוך 56 מ"ג של IAM.</li>
	<li>הכינו 10% TFA על ידי הוספת 1 מ"ל של חומצה טריפלואורואצטית (TFA) ל-9 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. מערבולת במשך 4 שניות ומסתובבת למטה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים.</li>
	<li>הכינו את Buffer A על ידי הוספת 1 מ"ל של 10% TFA ל-99 מ"ל של מים נטולי יונים.</li>
	<li>הכינו את Buffer B על ידי הוספת 1 מ"ל של 10% TFA, ו-49 מ"ל של מים נטולי יונים, לתוך 50 מ"ל של אצטוניטריל (ACN).</li>
	<li>הכינו חיץ היסטידין של 10 מ"מ על ידי הוספת 37 מ"ג של L-היסטידין ו-54.8 מ"ג של מונוהידרט L-היסטידין מונוהידרוכלוריד לתוך 50 מ"ל מים.</li>
</ol>2. הכנת פתרונות נוגדנים חד שבטיים (mAb)
<ol><li>עבור מוצרי תרופות עם ריכוזים מעל 50 מ"ג / מ"ל, לדלל 15 מ"ג של נוגדן חד שבטי (mAb) (ראה טבלה של חומרים) עם מים deionized בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל, וכתוצאה מכך נפח כולל של 300 μL ו pH סופי של ~ 6. במידת הצורך, התאם את ה- pH באמצעות חומצה אצטית או Tris-HCl.</li>
	<li>עבור מוצרי תרופות עם ריכוזים נמוכים מ-50 מ"ג/מ"ל, בצע החלפת חיץ לפי שלבים 2.2.1 עד 2.2.5.<ol><li>העבירו 20 מ"ג מכל דגימה להתקן מסנן צנטריפוגלי של 10,000 (ראו טבלת חומרים) ולצנטריפוגה במהירות של 14,000 x גרם למשך 25 דקות (בטמפרטורת החדר, RT) עד שיישאר נפח של כ-100 מיקרוליטר.</li>
		<li>הוסף 350 μL של 10 mM היסטידין (ראה טבלת חומרים), pH 6.0 חוצץ לתוך המסנן, מערבולת, וצנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 25 דקות ב RT. חזור על הפעולה פעם אחת.</li>
		<li>הפוך את המסנן והנח אותו בצינור איסוף הדגימות, ולאחר מכן בצע צנטריפוגה של הדגימות במהירות של 1000 x גרם למשך 5 דקות ב- RT כדי לאחזר את כל הנפח בצינור האיסוף. שטפו את המסנן עם 200 μLof 10 mM חיץ היסטידין וצינור למעלה ולמטה כדי לשחזר את דגימות החלבון שנותרו. מעבירים את התמיסה כולה לאותו צינור איסוף, מערבולת, ומסתובבים כלפי מטה.</li>
		<li>מדוד את ריכוז הדגימה באמצעות NanoDrop. התאימו את הריכוז של כל דגימת חלבון ל-50 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת חיץ היסטידין לפני הדגירה עם חרוזי העשרה.</li>
		<li>מעבירים 300 μL של הדגימה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת חרוזי העשרה פרוטאום
<ol><li>הסר את המכסה העליון והתחתון מכל עמודת ספין המתקבלת מערכת העשרת החלבונים המסחרית (ראה טבלת חומרים). אין להשליך את הכובעים, שכן הם ישמשו מאוחר יותר.</li>
	<li>קח את עמוד הסחרור ומקם אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ללא מכסה. צנטריפוגה את ההתקנה בטמפרטורת החדר ו-1,000 x גרם למשך 30-60 שניות ב-RT על מנת לחסל את פתרון האחסון. השליכו את החומר שנאסף במהלך שלב זה.</li>
	<li>הוסיפו חיץ כביסה של 200 μL לחרוזי ההעשרה הזמינים מסחרית (ראו טבלת חומרים) ופזרו מעלה ומטה מספר פעמים. מקם את עמוד הסחרור בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם למשך 30-60 שניות ב- RT כדי להסיר את החיץ. השליכו את החומר שנאסף. הערה: מאגר השטיפה כלול בערכת העשרת החלבון המסחרית.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.3 פעמיים.</li>
	<li>החלף את המכסה התחתון והוסף 200 מיקרוליטר מים, ולאחר מכן החלף את המכסה העליון.</li>
</ol>4. העשרת חלבונים
<ol><li>יש להעלות ולהוריד את הבוצה (משלב 3.5) ולהעביר 40 מיקרוליטר של תרחיף לדגימה שהוכנה בשלב 2. לדגור ולסובב את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.</li>
	<li>הכינו טיפ עם פריט (ראו טבלת חומרים) באמצעות מחט 16 גרם כדי לקבל את גודל הפריט המתאים, ואז הכניסו אותו לקצה הקצה של קצה 200 מיקרוליטר.</li>
	<li>העבר את הדגימה עם חרוזים לקצה שהוכן בשלב 4.2. צנטריפוגה את הקצה עם צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל ב 200 x גרם במשך 3 דקות ב RT כדי להסיר את התמיסה.</li>
	<li>שטפו את החרוזים על ידי הוספת חיץ כביסה של 200 μL לקצה וצנטריפוגו את הקצה עם צינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ב 200 x גרם למשך 2 דקות ב- RT כדי להסיר את תמיסת הכביסה. חזור על השלב פעמיים.</li>
	<li>שטפו את החרוזים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר מים לקצה וצנטריפוגו את הקצה עם צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל ב 200 x גרם למשך 2 דקות ב- RT כדי להסיר את המים.</li>
	<li>מוציאים חלבונים מחרוזים על ידי הוספת 10 μL של חיץ אלוציה (שלב 1.4) לקצה, ומזרימים את הבוצה עשר פעמים בקצה כדי להבטיח שהחרוזים ספוגים בחיץ אלוציה.</li>
	<li>צנטריפוגה את הקצה עם צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 0.5 מ"ל ב 200 x גרם במשך 30 שניות ב RT כדי לאסוף את eluent. חזור על שלבים 4.6-4.7 פעמיים ושלב את כל האלוציה לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד של 0.5 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 1.5 μL של תמיסת טריפסין (שלב 1.5) לתוך eluent לעיכול לילה ב 28 ° C. הוסף 1.5 μL של 25 מ"ג / מ"ל DTT (שלב 1.6), וחמם את הדגימה ב 90 ° C במשך 20 דקות.</li>
	<li>הוסף 1.5 μL של 0.25 M IAM (שלב 1.7) ודגור בטמפרטורת החדר בחושך במשך 20 דקות. הוסף 3.5 μL 10% TFA (שלב 1.8), מערבול במשך 2 דקות, וודא pH הוא ~ 2-3.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-14,400 × גרם למשך 10 דקות ב-RT כדי לזרז SDC ו-SLS. אספו את הסופרנאטנט להתפלה.</li>
	<li>בצע התפלה לפי השלבים הבאים.<ol><li>הוסף 50 μL של Buffer B (שלב 1.10) לקצה ההתפלה GC (ראה טבלת חומרים). צנטריפוגה את הקצה עם מחזיק ב 1000 x גרם במשך 3 דקות ב RT. יש להשליך את החומר שנאסף.</li>
		<li>הוסף 50 μL של Buffer A (שלב 1.9) לקצה. צנטריפוגה את הקצה עם מחזיק ב 1000 x גרם במשך 3 דקות ב RT. יש להשליך את החומר שנאסף.</li>
		<li>מוסיפים את הדגימה החומצית לקצה. צנטריפוגה את הקצה עם מחזיק ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב RT. להשליך את החומר שנאסף.</li>
		<li>שטפו את הקצה על ידי הוספת 50 μL של Buffer A לקצה. צנטריפוגה את הקצה עם המחזיק ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב RT. להשליך את החומר שנאסף. חזור על הפעולה פעם אחת.</li>
		<li>הוציאו את הפפטיד מהקצה על ידי הוספת 50 μL של Buffer B לקצה ההתפלה GC. צנטריפוגו את הקצה עם צינור חדש ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב RT. לאסוף את החומר. חזור על השלב פעם אחת ושלב את ה- eluent.</li>
		<li>יבשו את הנוזל בעזרת רכז ואקום (ראו טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>יש להשהות מחדש את החומר המיובש ל-30 מיקרוליטר של תמיסת 0.1% חומצה פורמית (FA).</li>
	<li>מדוד את UV של תערובות פפטידים ב 214 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר (ראה טבלת חומרים). הריכוז של תערובות פפטידים צריך לנוע בין 0.1 ל 0.5 מ"ג / מ"ל.</li>
	<li>העבירו 10 מיקרוליטר מכל דגימה מעוכלת לבקבוקון דגימת LC, ולאחר מכן הזריקו 1 מיקרוגרם מכל דגימה מעוכלת לננו LC-MS/MS (ראו טבלת חומרים). בצע את הניתוח לאחר שלב 5. אחסנו את שאר הדגימות המעוכלות במקפיא בטמפרטורה של -80°C.</li>
</ol>5. ניתוח ננו LC-MS/MS
<ol><li>הזריקו את תערובת הפפטיד למערכת ננו-LC המצומדת לספקטרומטר מסות. טען את תערובות הפפטידים (~1 מיקרוגרם) על עמודת מלכודת C18 עם השיפוע המסופק בטבלה 1A להתפלה ולאחר מכן על עמודה אנליטית C18 ב- 40 ° C להפרדה. הערה: מאגר פאזה A הנייד כלל 0.1% FA במים טהורים במיוחד, ושלב B הנייד כלל 0.1% FA ב-80% ACN.</li>
	<li>הפרידו את הפפטידים ובצעו elute בעזרת השיפוע המסופק בטבלה 1B עם קצב זרימה של 250 nL/min. הערה: ספקטרומטר המסות הופעל במצב תלוי נתונים (DDA) עם זמן מחזור של 3 שניות. היונים עברו פיצול באמצעות דיסוציאציה התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (HCD) עם אנרגיית התנגשות מנורמלת של 30% עבור כל סריקת טרשת נפוצה מלאה. הסריקות בוצעו ברזולוציה של 60,000, עם יעד בקרת רווח אוטומטית (AGC) של 3e6, זמן הזרקה מרבי של 20 מילישניות, וטווח m/z של 380-1600. אירועי MS/MS נערכו ברזולוציה של 15,000, עם יעד AGC של 1e5, זמן הזרקה מקסימלי של 60 מילישניות, וטווח m/z של 200-2000. משך ההרחקה נקבע ל-45 שניות. תכונות מקור היונים מופיעות בטבלה 1C, וניתן למצוא את הפרמטרים הספציפיים של ספקטרומטריית מסות בטבלה 2A-F.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>בצע חיפוש בקבצים הגולמיים של ספקטרומטריית המסות NISTmAb מול מסד הנתונים mus+musculus של UniProt29. בנוסף, חפש את הקבצים הגולמיים של ספקטרומטריית המסה mAb DS של חלבון רקומביננטי מול מסד הנתונים UniProt Cricetulus Griseus30. הערה: חיפושים אלה נערכו בתוכנת Proteome Discoverer (ראה טבלת חומרים) באמצעות מנועי החיפוש Sequest HT ו-Mascot. מאגרי המידע בהם נעשה שימוש היו נקיים מערכים מיותרים.</li>
	<li>עבור חיפושי ספקטרומטריית מסות, החל סובלנות מסה של 10 ppm, והגדר את סובלנות מסת השבר ל- 0.02 Da. הערה: קריטריוני החיפוש כללו קרבמידומתילציה סטטית של שאריות ציסטאין (+57.0214 Da) ושינוי משתנה של חמצון (+15.9949 Da) על שאריות מתיונין. בנוסף, הוחל שינוי משתנה של deamination (+0.984 Da).</li>
	<li>בצע את החיפוש במסד הנתונים באמצעות עיכול טריפסין, המאפשר מקסימום שני מחשופים שהוחמצו. הגדר את שיעורי גילוי השווא הן עבור חלבונים והן עבור פפטידים על 0.01. הערה: כדי לזהות באופן חיובי חלבוני תאים מארחים (HCPs), יושמה דרישת מינימום של לפחות שני פפטידים ייחודיים. טבלה 3 מספקת את הסיכום המייצג של HCPs מזוהים המשויכים ל- NIST mAb שנותחו על-ידי תוכנת Proteome Discoverer.</li>
</ol>

Enrichment of Host Cell Proteins in Monoclonal Antibody Drug Products

<ol>
	<li>Aboulaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+monitor+clearance+of+host+cell+proteins+associated+with+monoclonal+antibodies.">A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies.</a> Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).</li><li>Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+protein+removal+from+biopharmaceutical+preparations:+Towards+the+implementation+of+quality+by+design.">Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design.</a> Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).</li><li>Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+host+cell+protein+product-associated+impurities+in+monoclonal+antibody+bioprocessing.">Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).</li><li>Molden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+protein+profiling+of+commercial+therapeutic+protein+drugs+as+a+benchmark+for+monoclonal+antibody-based+therapeutic+protein+development.">Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development.</a> MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).</li><li>Bee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+levels+of+the+CHO+host+cell+protease+cathepsin+D+caused+particle+formation+in+a+monoclonal+antibody+product.">Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product.</a> Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).</li><li>Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+host+cell+protein+(HCP)+identification+during+process+development+and+manufacturing+linked+to+a+risk-based+management+for+their+control.">The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).</li><li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+a+difficult-to-remove+CHO+host+cell+protein,+lipoprotein+lipase,+for+improved+polysorbate+stability+in+monoclonal+antibody+formulations.">Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Gilgunn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+tracking+of+problematic+host+cell+proteins+removed+by+a+synthetic,+highly+functionalized+nonwoven+media+in+downstream+bioprocessing+of+monoclonal+antibodies.">Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies.</a> Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).</li><li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+polysorbate-degrading+enzymes+in+a+monoclonal+antibody+formulation.">Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).</li><li>Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysorbates+20+and+80+degradation+by+group+XV+lysosomal+phospholipase+A2+isomer+X1+in+monoclonal+antibody+formulations.">Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).</li><li>Jones, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;High-risk&amp;#34;+host+cell+proteins+(HCPs):+A+multi-company+collaborative+view.">34;High-risk&amp;#34; host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view.</a> Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+residual+host+cell+protein+hexosaminidase+B+associated+with+N-glycan+degradation+during+the+stability+study+of+a+therapeutic+recombinant+monoclonal+antibody+product.">Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product.</a> Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+specific+causes+of+polysorbate+20+degradation+in+monoclonal+antibody+formulations+containing+multiple+lipases.">Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases.</a> Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).</li><li>Zhang, S., Xiao, H., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+polysorbate+20+by+Sialate+O-Acetylesterase+in+monoclonal+antibody+formulations.">Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).</li><li>Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+polysorbate+80+degradation+by+liver+carboxylesterase+in+a+monoclonal+antibody+formulated+drug+substance+at+early+stage+development.">Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).</li><li>Gunawan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+platform+host+cell+protein+ELISA+to+process-specific+host+cell+protein+ELISA.">Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).</li><li>Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+host+cell+protein+analysis+in+monoclonal+antibody+products+through+molecular+weight+cutoff+enrichment.">Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment.</a> Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).</li><li>Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+host+cell+protein+analysis+in+monoclonal+antibody+products+through+ProteoMiner.">Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner.</a> Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).</li><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography.">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+sample+preparation+for+shotgun+proteomics+characterization+of+HCPs+in+antibodies.">A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).</li><li>Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FAIMS,+Protein+A+depletion,+and+native+digest+conditions+enables+deep+proteomic+profiling+of+host+cell+proteins+in+monoclonal+antibodies.">Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).</li><li>Kreimer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+protein+profiling+by+targeted+and+untargeted+analysis+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometry+data+with+parallel+reaction+monitoring+verification.">Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).</li><li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+characterization+of+host+cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions,+LC-MS/MS,+and+multivariate+analysis.">Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis.</a> MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).</li><li>Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+sensitive+method+for+deep+profiling+of+host+cell+proteins+in+therapeutic+antibodies+by+combining+ultra-low+trypsin+concentration+digestion,+long+chromatographic+gradients,+and+boxcar+mass+spectrometry+acquisition.">Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition.</a> Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).</li><li>Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+LC-MS-Based+workflow+with+robust+0.1+ppm+sensitivity+for+identifying+residual+HCPs+in+biotherapeutic+products.">Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products.</a> Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).</li><li>Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+tracking+of+host+cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry.">Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+phospholipase+B-Like+2+is+not+responsible+for+polysorbate+degradation+in+monoclonal+antibody+drug+products.">Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).</li><li>Zhang, J., He, J., Smith, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+can+induce+the+formation+of+proteinaceous+particles+in+monoclonal+antibody+formulations.">Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).</li><li>Uniprot1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2023).</li><li>Uniprot2. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2023).</li></ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

ישנן שתי גרסאות של חרוזי העשרת חלבון הזמינים באופן מסחרי: אחת עם קיבולת קטנה יותר והשנייה עם קיבולת גדולה יותר (ראה טבלת חומרים). שתי הגרסאות של חרוזי ההעשרה מכילות עשרה פרפים באריזה. הוראות היצרן מציעות כי כל הכנה מתוך ערכת קיבולת קטנה ניתן להשתמש כדי להעשיר 10 מ"ג של חלבון כולל. עם ...

חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים המשתחררים מתרבית התאים של האורגניזם המארח ומטוהרים במשותף עם נוגדן חד-שבטי (mAb)1,2,3,4. רמות עקבות של HCPs יכולות להשפיע לרעה על איכות מוצר התרופה 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, ולכן, שיטת ניתוח HCP רגישה רצויה כדי לזהות HCPs ברמות sub-ppm ל- ppm.
שיטות אורתוגונליות ניתן ליישם כדי לזהות HCPs בשפע נמוך. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) משמשת בדרך כלל לכימות HCPs כולל, והיא יכולה גם לזהות ולכמת HCPs בודדים אם הנוגדנים המתאימים זמינים16. עם זאת, הייצור של נוגדנים ספציפיים HCP הוא זמן רב ועבודה אינטנסיבית. לעומת זאת, כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (LC-MS) יכולה לספק מידע מקיף על HCPs בודדים במוצרי תרופות mAb והיא מיושמת באופן נרחב לזיהוי HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
מספר שיטות פותחו כדי לזהות HCPs עם LC-MS/MS, כולל עיכול מוגבל20, סינון17, חלבון A מחיקה21, משקעים חיסוניים (IP), והעשרת ProteoMiner (PM)18. רוב השיטות שואפות להפחית את כמות mAb ולהעשיר HCPs לפני ניתוח LC-MS/MS, ובכך להקטין את הטווח הדינמי בין פפטידים mAb ופפטידים HCP. פרוטוקול זה מציג שיטת העשרת דגימות פרוטאומית המשלבת טכנולוגיית ProteoMiner ועיכול מוגבל (PMLD)28. עקרון ההעשרה של ProteoMiner כולל שימוש בחרוזי העשרת פרוטאום הזמינים מסחרית המכילים ספרייה מגוונת של ליגנדות פפטידים קומבינטוריות. ליגנדות אלה נקשרות באופן ספציפי לחלבונים על תוצרי נוגדנים-תרופות, ומאפשרות הסרה של מולקולות עודפות תוך ריכוז חלבוני תאים מארחים בעלי שפע נמוך (HCPs) בליגנדות הזיקה שלהם. מצד שני, העיקרון של עיכול מוגבל כרוך בשימוש בריכוז נמוך של טריפסין. ריכוז זה מספיק כדי לעכל HCPs בשפע נמוך, אבל לא מספיק כדי לעכל את כל מוצרי התרופות נוגדנים. גישה זו מאפשרת שחזור והעשרה של פפטידי HCP מעוכלים מהתמיסה.
בהשוואה לשיטות סינון, טכניקת PMLD אינה מוגבלת על ידי גודל HCPs17 שזוהו. שיטות המחיקה של חלבון A הן ספציפיות לאיתור HCPs הקשורים לנוגדנים21, בעוד שמשקעים חיסוניים מוגבלים ל- HCPs מוגדרים מראש מקו תאים מסוים (כגון קו תאי השחלה של האוגר הסיני (CHO), שם נוצר נוגדן נגד HCP4. לעומת זאת, PMLD יכול להיות מיושם כדי לזהות HCPs מכל מודולי התרופה וחלבוני התא המארח מטוהרים יחד עם מוצרי תרופות מקווי תאים שונים. בנוסף, PMLD מציג רגישות טובה יותר בהשוואה לשיטות שהוזכרו 17,18,20,21,24.
גישה זו יכולה להעשיר את ריכוז HCP פי 7000 ולהוריד את מגבלת הזיהוי ל 0.002 ppm28. מערך הניסוי מומחש באיור 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>91016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm &#215; 0.075 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>164535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade&#160;</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>LS120-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 analytical column (0.075 mm &#215; 1.7 &#956;m &#215; 30 cm, 100 &#197;)</td>
			<td>CoAnn Technologies</td>
			<td>HEB07503001718I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A39255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL-Tip GC</td>
			<td>GL Sciences Inc&#160;&#160;</td>
			<td>7820-11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in-house mAb</td>
			<td>Regeneron</td>
			<td></td>
			<td>concentration 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A39271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>149320025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine monohydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A456-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>30035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Exploris 480</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BRE725539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf (VWR)</td>
			<td>22431064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf (VWR)</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer software 2.4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1633007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1633006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7970010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoracetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (Sequencing Grade Modified)&#160; (5 x 20 ug)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver Rotator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLC nano system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade&#160;</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>LS118-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

host cell protein analysis using enrichment beads coupled with limited digestion

חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים שיכולים להשפיע לרעה על חלבונים טיפוליים, אפילו בכמויות קטנות. כדי להעריך את הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים למוצרי תרופות, פותחו שיטות לזיהוי HCP בשפע נמוך. גישה חיונית לפיתוח שיטת זיהוי HCP רגישה כוללת העשרת HCPs ובו זמנית הסרת נוגדנים חד שבטיים (mAbs) לפני הניתוח, תוך שימוש בספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS).
פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות להעשרת חלבוני התא המאכסן באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום הזמינים מסחרית. חרוזים אלה מכילים ספרייה מגוונת של ליגנדות הקסה-פפטידים עם זיקות ספציפיות לחלבונים שונים. הפרוטוקול משלב גם עיכול מוגבל וזיהוי פפטידים לאחר מכן באמצעות ננו LC-MS/MS. על ידי שימוש בטכניקות אלה, HCPs עם שפע נמוך ניתן להעשיר מעל 7000 פעמים, וכתוצאה מכך מגבלת זיהוי מרשימה נמוכה כמו 0.002 ppm. באופן משמעותי, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של 850 HCPs עם רמה גבוהה של ביטחון באמצעות NIST mAb. יתר על כן, הוא נועד להיות ידידותי למשתמש וכולל הדגמת וידאו כדי לסייע ביישומו. על ידי ביצוע צעדים אלה, חוקרים יכולים להעשיר ולזהות ביעילות HCPs, לשפר את הרגישות והדיוק של הערכת סיכונים עבור מוצרי תרופות.

Host cell proteins (HCPs) are impurities that are released from the cell culture of the host organism and co-purified with monoclonal antibody (mAb)1,2,3,4. Trace levels of HCPs can negatively impact the quality of the drug product5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, and therefore, a sensitive HCP analysis method is desired to detect HCPs in sub-ppm to ppm levels.
Orthogonal methods can be applied to detect HCPs in low abundance. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is generally used to quantitate overall HCPs, and it can also detect and quantitate individual HCPs if the corresponding antibodies are available16. However, the production of HCP-specific antibodies is time-consuming and labor-intensive. In contrast, liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS) can provide comprehensive information about individual HCPs in mAb drug products and is widely applied for HCP identification4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.
Several methods have been developed to detect HCPs with LC-MS/MS, including limited digestion20, filtration17, Protein A deletion21, immunoprecipitation (IP), and ProteoMiner enrichment (PM)18. Most methods aim to reduce the amount of mAb and enrich HCPs prior to LC-MS/MS analysis, thereby decreasing the dynamic range between mAb peptides and HCP peptides. This protocol presents a proteomic sample enrichment method that combines ProteoMiner technology and limited digestion (PMLD)28. The ProteoMiner enrichment principle involves using commercially available proteome enrichment beads containing a diverse library of combinatorial peptide ligands. These ligands specifically bind to proteins on antibody-drug products, allowing for the removal of excess molecules while concentrating low-abundance host cell proteins (HCPs) on their respective affinity ligands. On the other hand, the principle of limited digestion involves using a low concentration of trypsin. This concentration is sufficient to digest low-abundance HCPs but not enough to digest all antibody drug products. This approach enables the recovery and enrichment of digested HCP peptides from the solution.
Compared to filtration methods, the PMLD technique is not limited by the size of the detected HCPs17. Protein A deletion methods are specific to detecting HCPs associated with antibodies21, while immunoprecipitation is restricted to predefined HCPs from a particular cell line (such as the Chinese Hamster Ovary (CHO) cell line), where an anti-HCP antibody was generated4. In contrast, PMLD can be applied to detect HCPs from any drug modules and host cell proteins co-purified with drug products from various cell lines. Additionally, PMLD exhibits better sensitivity compared to the mentioned methods17,18,20,21,24.
This approach can enrich the HCP concentration by 7000-fold and lower the detection limit to 0.002 ppm28. The experimental setup is illustrated in Figure 1.

Author Spotlight: Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion 

ניתוח חלבון התא המארח באמצעות חרוזי העשרה בשילוב עם עיכול מוגבל

פרוטוקול זה הציג תהליך הכנת דגימה, המכונה העשרת חלבונים יחד עם עיכול מוגבל (PMLD), לניתוח חלבוני התא המארח (HCPs) בדגימת נוגדנים חד-שבטיים (mAb). איור 1 מדגים את התהליך שלב אחר שלב של PMLD. החוקרים השוו את התוצאות של ניתוח HCP באמצעות עיכול ישיר (מוצג בפאנל העליון של איור 2) ו-PMLD (מוצג בפאנ...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion at JoVE.com

מוצג פרוטוקול להעשרת חלבוני התא המאכסן (HCPs) ממוצרי תרופות (DP) ואיתור פפטידים באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום. השיטה מודגמת באמצעות חומר תרופתי נוגדן חד-שבטי (mAb) (DS), שהוא חומר ייחוס מאופיין היטב להערכה והשוואה של שיטות שונות מבחינת ביצועים.

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

פיתחנו שיטה רגישה ביותר לזיהוי חלבוני התא המאכסן בעלי השפע הנמוך ממוצר התרופה באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום. גישה זו מסייעת לנו למצוא את שורש הבעיה ואת הסיכון הכרוך במוצר התרופה. ישנן דרכים רבות לשפר את מגבלת הזיהוי של ניתוח HCP, השיטה הבלתי ממוקדת הכוללת אך לא מוגבלת לדלדול חלבון A, העיכול המוגבל, הירידה במשקל המולקולרי, המשקעים החיסוניים.הדרך הממוקדת לזהות את חלבון התא המארח, כולל כרומטוגרפיה נוזלית, ניטור תגובות מרובות וניטור תגובה מקבילית של כרומטוגרפיה לא נוזלית. האתגר העיקרי הקשור לניתוחי HCP אלה הוא הטווח הדינמי המשמעותי בין תרופת נוגדנים לחלבוני התא המארח. לכן, רוב השיטות שואפות להפחית את כמות הנוגדנים ואת HCP להעשיר לפני ניתוח LCMS כדי להקטין את הטווח הדינמי בין פפטידים נוגדנים ופפטידים HCP.לכן, טכנולוגיית ProteoMiner ופרוטוקול העיכול המוגבל משפרים באופן משמעותי את גבול הזיהוי של ניתוח HCP בהשוואה לשיטות אחרות. זה לא מוטה בהשוואה למשקעים חיסוניים וניתן ליישם אותו על מודול תרופות שונה בהשוואה לשיטת דלדול חלבון A. פרוטוקול זה הוא גם פשוט ופשוט.לכן, טכנולוגיית ProteoMiner ופרוטוקול העיכול המוגבל עוזרים לנו לזהות מספר HCPs המפרקים פוליסורבט ואת תרופת נוגדני הפרגמנט. בשילוב עם שיטת ננו LCMPRM, שיטת ההעשרה יכולה גם לספק תוצאות כמותיות למציאת הריכוז הרלוונטי ביולוגית של חלבוני התא המארח הבעייתיים.

host-cell-protein-analysis-using-enrichment-beads-coupled-with

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Chemistry

Unit 1

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

Pharmacokinetics: Drug Distribution and Protein Binding

SCIENTISTS IN ACTION

1.6K Views.  Regeneron Pharmaceuticals Inc.. פיתחנו שיטה רגישה ביותר לזיהוי חלבוני התא המאכסן בעלי השפע הנמוך ממוצר התרופה באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום. גישה זו מסייעת לנו למצוא את שורש הבעיה ואת הסיכון הכרוך במוצר התרופה. ישנן דרכים רבות לשפר את מגבלת הזיהוי של ניתוח HCP, השיטה הבלתי ממוקדת הכוללת אך לא מוגבלת לדלדול ח?...

Video: Author Spotlight: Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion 

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks associated with drug products, methods have been developed to identify low-abundance HCPs. A crucial approach for developing a sensitive HCP detection method involves enriching HCPs while simultaneously removing monoclonal antibodies (mAbs) before analysis, utilizing liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
This protocol offers detailed instructions for enriching host cell proteins using commercially available proteome enrichment beads. These beads contain a diverse library of hexapeptide ligands with specific affinities for different proteins. The protocol also incorporates limited digestion and subsequent peptide detection using nano LC-MS/MS. By employing these techniques, HCPs with low abundance can be enriched over 7000-fold, resulting in an impressive detection limit as low as 0.002 ppm. Significantly, this protocol enables the detection of 850 HCPs with a high level of confidence using a NIST mAb. Moreover, it is designed to be user-friendly and includes a video demonstration to assist with its implementation. By following these steps, researchers can effectively enrich and detect HCPs, enhancing the sensitivity and accuracy of risk assessment for drug products.

A protocol is presented for enriching host cell proteins (HCPs) from drug products (DP) and detecting peptides using proteome enrichment beads. The method is demonstrated using an in-house manufactured monoclonal antibody (mAb) drug substance (DS), which is a well-characterized reference material for evaluating and comparing different methods in terms of performance.