יערות קלפ עומדים בפני הפסדים חסרי תקדים עקב גורמי עקה סביבתיים המונעים על ידי האקלים ושינויים בדינמיקה הטרופית. סרטון זה מדגים פרוטוקול וכלים לגידול אצות ענק, Macrocystis pyrifera, תוך שימוש בטכניקת החצץ הירוק, ומספק משאב רב ערך לניסויים נוספים כדי להתמודד עם ההצלחות והמגבלות של שיטה זו בסביבות שונות. מתקני גידול קלפ חייבים להיות מסוגלים לשלוט בטמפרטורות הנעות בין 10 ל -15 מעלות צלזיוס, לספק אור ספקטרום מלא הנע בין אפס ל -180 פוטונים מיקרומול למטר שנייה בריבוע, ואוורור מסונן.
ניתן להתאים מערכות אינקובטור עם שקע מובנה, או יציאת גישה לחוטים וצינורות עם אורות ומקור אוויר. אם מערכת החממה אינה במסגרת הפרויקט, תקציבו או קנה המידה המיועד, ניתן להשתמש באמבטיות מים הממותנות במי ים טבעיים קרים, או בצ'ילר. טמפרטורות הגידול הן ספציפיות לאתר ולעונה.
מקמו מדחום במצע גידול, או השתמשו באקדח טמפרטורה כדי להבטיח שהטמפרטורה תהיה בין 10 ל -18 מעלות צלזיוס. הגדר אורות ספקטרום מלא לתקופת צילום חשוכה של 12 שעות אור ו- 12 שעות באמצעות הגדרות התזמון במקור האור, או על-ידי חיבור מקור האור לטיימר עם מחזור הניתן לתכנות. מדדו את עוצמת האור באמצעות מד קוונטי PAR מתחת לפני השטח ליד החצץ וכווננו באמצעות מקור אור הניתן לעמעום, או באמצעות שכבות רשת על מקור האור.
אוורור מתווסף לתרבויות עם שימוש במשאבות אוויר. השתמש במסננים בגודל נקבוביות של 02 מיקרומטר כדי להפחית זיהום חיידקי הנישא באוויר. חומרים ותחנות יש לעקר ולהכין מראש.
עיין בטקסט לקבלת פרטים. חצץ המשמש לזריעה צריך להיות בעל מרקם, או משטח מגולען מעט, שכן גמטופיטים נוטים יותר להישמר על מצעים עם רוגוזיות גבוהה. יש לקרצף ולשטוף חצץ עד שהמים זורמים צלולים כדי להסיר אבק או לכלוך.
השרו חצץ בתמיסת אקונומיקה מדוללת ב-10% למשך 24 שעות לפחות, ושטפו במי ים מעוקרים בפילטר. חשב את נפח מי הים המעוקרים במסנן הדרוש לרענון מיכלי תרבית מדי שבוע, ותזמן את משימת הסינון והעיקור בהתאם. ניתן לאחסן אצוות גדולות של מי ים מעוקרים במסנן במיכלים חשוכים למשך עד שישה חודשים בטמפרטורה של שמונה עד 10 מעלות צלזיוס.
אם אין מקרר, יש לאחסן באזור חשוך וקריר. סנן מים באמצעות מערכת סינון ואקום בגודל נקבוביות של 55 עד מיקרומטר אחד. כבו את מקור הוואקום לפני שכל המים נמשכים דרכו כדי למנוע נזק לפילטר, ושפכו את המים המסוננים למיכל סטרילי ייעודי.
עבור נפחים גדולים יותר, ניתן להשתמש במערכת סינון זרימה. לדוגמה, להזרים מי ים דרך סדרה של שלושה מסננים עם קפלים, 10 מיקרומטר, חמישה מיקרומטרים ומיקרומטר אחד, המסודרים מגודל הנקבוביות הגדול ביותר לקטן ביותר. מערכת זרימה זו מחוברת לאור UV באקווריום.
עיקור מי ים מסוננים בשיטות UV ו / או autoclaving. העשרה של מי ים מעוקרים במסננים עם חומרים מזינים וויטמינים היא קריטית לצמיחת אצות ים. אפשרויות העשרה נפוצות כוללות מדיית מי ים מועשרת בפרובאסולי ומדיית F/2.
עיין בטקסט לקבלת פרטים. השג את האישורים הדרושים לאיסוף רקמות אצות ים העומדים בחוקים ובתקנות המקומיים. על ידי צלילה, בחר שלושה עד חמישה להבי ספורופיל מ -10 עד 15 פרטים פוריים Macrocystis pyrifera עם סורי גלוי במרווחים של שניים עד חמישה מטרים זה מזה.
בחר ספורופילים נקיים ושלמים במידת האפשר, עם מעט או ללא עכירות, או השפלה. יש לאחסן את להבי הספורופיל בנפרד בהתאם להורה מנקודה זו ואילך. ספורופילים גדלים בחצאית צפופה בבסיס מעל אחיזת הקלפ הבוגרת, וניתן לזהותם על פי היעדר פנאומטוציסטים מלאים בגז.
יש להעביר להבי ספורופיל בשקיות איסוף כהות כדי למנוע חשיפת יתר לאור שמש מלא במי ים מהאתר כדי לשמור על להבים רטובים ומאוחסנים בצידניות בטמפרטורה של כ-12 מעלות צלזיוס עד ההגעה לחלל הגידול. ודא שהדגימות אינן במגע ישיר עם קרח. ניתן לשלוח ספורופילים למקומות אחרים או מהם.
יש לשטוף ספורופילים במי ים מעוקרים מסוננים. יש לעטוף להבים שנאספו מאדם בודד מסוג Macrocystis pyrifera במגבות נייר לחות ספוגות במי ים מעוקרים מסוננים, ושוב ברדיד אלומיניום כדי למנוע חדירת אור והתייבשות נוספת. שיטת אחסון זו ידועה בכינויה שיטת הבוריטו.
הניחו את האריזות בצידנית עם קרח עם מחסום מגן, כגון ניילון בועות ממוחזר, או קרטון. הכינו את הצידנית למשלוח לילה וודאו שמישהו זמין לקבל את המשלוח והניחו את החבילות בתנאי קירור. לחלופין, אחסנו ספורופילים למשך 12 עד 48 שעות בתנאי קירור, מה שמעודד שחרור נבגים מרקמת סורוס.
לאחסון, השתמשו בשיטת הבוריטו. אם האחסון אופציונלי, מצא עדות לנבג חלקי על מגבות הנייר המעיד על נוכחות של רקמת סורוס פורייה. רקמת סורוס היא לעתים קרובות מעט מוגבהת ובצבע כהה יותר מאשר הרקמה שמסביב.
בחרו רקמת סורוס בשלה, וחתכו למקטעים בריבוע של 25 ס"מ בעזרת מספריים סטריליים. בחרו אחד או שניים מחלקי סורי נקיים מתוך 10 עד 15 הורי אצות ים בודדים כדי לקדם את הגיוון הגנטי. כדי לנקות, יש לקרצף בעדינות את שני צידי רקמת הסורוס בכיוון אחד בלבד בעזרת גזה סטרילית ספוגה במי ים מעוקרים בפילטר.
במידת הצורך, גרדו את רקמת הסורוס בעדינות בעזרת סכין גילוח סטרילי. יש לטבול את החלק הסורי באמבט מים מתוקים למשך 30 שניות עד דקה, ולשטוף במי ים מעוקרים באמצעות פילטרים. יש לטבול כל חלק סורי במי ים מעוקרים במסנן בטמפרטורה של 10 עד 15 מעלות צלזיוס בתוך צינור פלקון סטרילי של 50 מיליליטר.
לחלופין, חלקי סורי יכולים לנבג במיכל סטרילי יחיד. מניחים את הצינורות בטמפרטורה של ארבע עד 12 מעלות צלזיוס בחושך כדי לנבג במשך ארבע שעות לכל היותר. אם אין מקרר זמין, יש לאחסן באזור קריר ומואר חלש.
באמצעות מיקרוסקופ מורכב המוציטומטר, לבחון את צפיפות הנבג של שלוש עד ארבע דגימות כל 30 דקות עד ארבע שעות. החליפו קצוות פיפטה בין דוגמאות. אם הצפיפות היא לפחות 10, 000 נבגים למיליליטר, עבור לשלב הבא.
אם קטע סורי אינו מייצר נבגים לאחר ארבע שעות, השליכו את הדגימה. נבגים יכולים לשקוע בתוך שעות לאחר שחרורם, אך ניתן לצפות בהם שוחים בתנועה מעגלית. הסר כל אחד מחלקי הסורי מצינורות הפלקון שלהם.
שלב את תמיסות הנבגים המתקבלות למיכל מעוקר יחיד וכמת את הצפיפות המשולבת הסופית. חשב את הנפח הסופי של תמיסת הנבגים הדרושים לחיסון לריכוז סופי של 500 עד 1, 000 נבגים למיליליטר במיכלי תרבית. עיין בטקסט לקבלת פרטים.
מקמו מגלשות זכוכית סטריליות בתוך מיכלי תרבית כדי לעקוב אחר התפתחות אצות הים. כלול לפחות 30 שקופיות המופצות באופן אקראי בין מכלי תרבות לניטור מספק. יש לחסן את הנפח המחושב של תמיסת הנבגים במיכל התרבית באמצעות קצה פיפטה סטרילי המכיל מצעים השקועים במצע גידול.
סגרו את המיכל וערבבו בעדינות לפיזור נבגים. הכניסו את המיכל למערכת התרבות שלכם. הגדר את הטמפרטורה בין 10 ל- 15 מעלות צלזיוס בהתבסס על הטמפרטורה באתר הפריסה.
אורות ספקטרום מלא לצמחי מים מוגדרים למחזור אור של 12 שעות, 12 שעות חושך עם עוצמות אור שנעות בין אפס ל -180 פוטון מיקרומול למטר שנייה בריבוע. ראה טקסט עבור ציר זמן של תנאי תאורה ספציפיים. לאחר יום אחד, ספקו אוורור אור עם מקור אוויר מסונן.
עקוב אחר לפחות שתי שקופיות זכוכית אקראיות מדי יום, או פעם ביומיים בשבועיים הראשונים כדי להעריך את ההתפתחות. לאחר שבועיים, עקבו אחר לפחות שתי שקופיות זכוכית אקראיות פעם עד פעמיים בשבוע לגדילה בריאה וזיהום עד שהספורופיטים מגיעים לגודל של סנטימטר עד שני סנטימטרים. כדי לפקח על המגלשה, טפל במגלשה עם פינצטה מעוקרת והנח בצלוחית פטרי נקייה המכילה מספיק מי ים מעוקרים כדי לטבול את מגלשת הזכוכית.
אין להחזיר מגלשות זכוכית לתרביות לאחר הסרתן כדי למנוע זיהום צולב. השתמש בתרכובת, או במיקרוסקופ הפוך בהגדלה של 40 עד 400x כדי לצפות באצות ים בשלב מוקדם. הפיתוח צפוי לעקוב אחר ציר הזמן הבא.
נבגים מיושבים נצפים באפס עד יום אחד. נבגים יכולים לנבוט תוך מספר שעות המודגמות על ידי היווצרות צינור נבט. נביטה נצפתה בדרך כלל לאחר יום עד יומיים.
גמטופיטים מוקדמים נצפים בדרך כלל לאחר יום עד ארבעה ימים. גמטוגנזה, התהליך שבו תאים עוברים חלוקה והתמיינות ליצירת גמטות זכריות ונקביות, נצפית בדרך כלל בשבועיים הראשונים. תאי הנקבה גדולים פי חמישה עד שבעה מהזכרים.
הגמטופיטים הזכרים מגדלים ענפים דקים וחוטיים, בעוד שהנקבות עגולות יותר, או ביציות יותר בצורתן. הנקבות מייצרות בדרך כלל ביצים תוך שבועיים עד שלושה. זרע המשתחרר מהזכרים מפרה את הביציות, המתפתחות לספורופיטים עובריים.
ספורופיטים נצפים בדרך כלל תוך שבועיים עד ארבעה שבועות. הזיגוטה עוברת חלוקת תאים מהירה, וכתוצאה מכך גדלים להבים של סנטימטר אחד עד שניים בתוך כשישה עד שמונה שבועות. בכל שבוע, לשנות את המדיה הצמיחה כדי לחדש את החומרים המזינים הדרושים ומינרלים עבור צמיחה Macrocystis pyrifera.
מצננים מצעי גידול טריים לטמפרטורה המתאימה. ודא שמצע הגידול אינו עולה על 15 מעלות צלזיוס במהלך תהליך זה. יש לשאוב מדיה ממיכלי הגידול שלך כדי למנוע הפרעה של מצעי זרעים.
תן למדיה להתרוקן עד שהמכל כמעט ריק. רענן את המדיה באופן מיידי כדי למזער התייבשות. הטו מעט את מיכלי הגידול בעת מילוי מחדש, כך שהמדיה תזרום לאורך הצד של מיכל הגידול כדי להפריע למצעים באופן מינימלי.
סדרו מחדש באופן אקראי את מיקומי המיכל או הגיגית במהלך שינויי מדיה שבועיים כדי להתחשב בהבדלים בקרינת האור. עיין בטקסט עבור לוח שנה כדי לעקוב אחר פעילויות וציפיות עבור תרביות Macrocystis. זה מציין את העיתוי של התאמות לאור ואוורור, כמו גם שינויים שבועיים במדיה.
לאחר שישה עד שמונה שבועות של תרבית במעבדה, ספורופיטים צעירים הם באורך של סנטימטר עד שני סנטימטרים ומוכנים לפריסה. רענן את מדיית הצמיחה בגורמים מכילים של תרביות 24 שעות לפני הפריסה. השג את האישורים הדרושים לפריסת חצץ העומדים בחוקים ובתקנות המקומיים.
הובלת חצץ ירוק עד שש שעות בצידנית מוצלת. יש לתזמן את הפריסה כדי למנוע את אור השמש הישיר ביותר. השתמש במבנה מוצל על הסירה כדי למנוע שמש ישירה במהלך תהליך הפריסה.
פזרו בזהירות חצץ ירוק מפני השטח אל השונית שמתחת, או באמצעות צלילה בעת ניסויים באתרים חדשים ובקנה מידה קטן. טכניקת שיקום החצץ הירוק עדיין נמצאת בשלב האקדמי עם נתוני הישרדות מוגבלים של צמחים חיצוניים עבור מינים אחרים ואין עדיין נתונים עבור Macrocystis pyrifera. עם זאת, הצלחה בתחום נצפתה במחקר פיילוט שנערך לאחרונה, וצוין על ידי חיבור הפטרה למצע שמסביב ואצות צעירות הגדלות עד 1.2 מטר לאחר חודשיים בשטח.
באמצעות איסוף השדה ותחזוקת המעבדה המתוארים בפרוטוקול זה, תרבינו שתי אוכלוסיות אצות תורמות נפרדות בטמפרטורה של 12 מעלות צלזיוס ו-20 מעלות צלזיוס כדי להבהיר השפעות תלויות טמפרטורה על התפתחות מיקרו-שלבים של Macrocystis pyrifera לאורך זמן. לאחר 24 ימים, גמטופיטים נספרו מתמונות מיקרוסקופ. הטמפרטורה השפיעה על אוכלוסיית K1 הקרירה יותר, אך לא על אוכלוסיית K4, מה שמרמז על סטייה אדפטיבית אפשרית בתכונות סבילות תרמית.
זה מדגיש את החשיבות של טמפרטורות גידול ספציפיות לאתר. לאחר 32 יום, ספורופיטים גלויים נספרו על כל שקופית זכוכית. לטמפרטורה הייתה השפעה דומה הן עבור אוכלוסיות K1 והן עבור אוכלוסיות K4.
דגימות שגודלו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס גידלו מעט ספורופיטים נראים לעין בהשוואה לאלה שגודלו בטמפרטורה של 12 מעלות צלזיוס. תוצאה זו מצביעה על כך שייצור ספורופיטים רגיש יותר לטמפרטורה מאשר שלב הגמטופיטים, וכי אסור שטמפרטורת הרבייה תעלה על 15 מעלות צלזיוס כדי להשיג התפתחות ספורופיטים, כפי שמתואר בפרוטוקול. באמצעות פרוטוקול דמיוני זה, אנו מקווים לעודד ניסויים נוספים בשיטת החצץ הירוק כדי לשדרג את השיקום של יערות אצות ים תת-ימיים יקרי ערך על ידי חוקרים ומנהלים ברחבי העולם.
בהצלחה במסע החצץ הירוק שלך עם Macrocystis pyrifera.
