אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו

אנו חוקרים את דינמיקת התנועה של מרכיבים שונים של הרפליזום האיקריוטי ברמת המולקולה היחידה. על מנת לקבל הבנה כמותית עמוקה של האופן שבו תאים יכולים לשכפל את כל הגנום שלהם, בכל מחזור תא. בפריצת דרך בשנת 2015, שכפול DNA אאוקריוטי נבנה מחדש במלואו במבחנה מרכיבי חלבון מטוהרים.

וזה נתן לנו הרבה שליטה על המערכת. ומאז, נעשה בו שימוש נרחב כדי לענות על שאלות על שלבים שונים של שכפול דנ"א ברזולוציה זמנית ומרחבית הולכת וגוברת. וזה נעשה באמצעות גישות משלימות כגון cryo EM וביופיזיקה של מולקולה בודדת.

בתחום המולקולה הבודדת, אחד האתגרים הגדולים ביותר במערכת זו הוא מספר החלבונים המעורבים וגם הריכוזים שבהם רכיבים אלה נדרשים על מנת למקסם את יעילות התגובה הכוללת מכיוון שהדבר עלול לסבך את הדמיית המולקולה הבודדת. הפרוטוקול המתואר כאן מציג גישה היברידית שבה קומפלקס חלבונים מורכב תחילה בצורה יעילה באמצעות ביוכימיה אנסמבל לפני שהוא מוצג ונחקר בסביבה של מולקולה אחת. זה מונע הכנסה של שני ריכוזי חלבון גבוהים ברמת המולקולה הבודדת.

אנו מדגימים גישה זו לחקר ההתנהגות של מנחת המסוקים המשוכפל CMG על דנ"א ברמת המולקולה הבודדת לאחר הרכבתו דרך מסלול מבוסס מקור. אבל גישה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את הדינמיקה של סוגים רבים אחרים של מתחמי חלבון קושרי DNA.